Epidemiology of Hepatitis E in Spain: Zoonotic implication of domestic and wild reservoirs

Abstract

Hepatitis E virus (HEV) is an emerging and zoonotic pathogen of worldwide distribution, which affects at least 20 million of humans annually, being recognized as the main cause of acute human viral hepatitis. In industrialized countries, HEV is mainly transmitted through the consumption of animal products or contact with faeces of infected animals. Although domestic pig and wild boar (Sus scrofa) are the main reservoirs of the zoonotic genotypes of the virus, the information about HEV circulation in animal species in the Iberian Mediterranean ecosystems is still very limited. In addition, despite the number of host and animal reservoirs has considerably increased since the first description of HEV in an animal host in 1997, the role of non-suid domestic and wildlife species in the epidemiology of HEV is poorly understood. Thus, the main general objective of this PhD thesis is to assess HEV circulation in domestic (Chapter 1) and wild (Chapter 2) animal species, including free-ranging and captive animals, in Spain. For this purpose, severalstudies were developed and are presented here under nine main headings. In the first study (Chapter 1.1), Orthohepevirus circulation, including HEV-A, HEV-B and HEV-C species, was assessed in sympatric urban cats and dogs in southern Spain. The presence of anti-HEV antibodies was detected in a total of 19 (6.4%; 95%CI: 3.6-9.2) of the 296 animals by ELISA. Seropositivity was significantly higher in dogs (9.9%; 15/152; 95%CI: 5.1-14.6) than in cats (2.8%; 4/144; 95%CI: 0.1-5.5) (p=0.011). Ten of the 18 ELISA-positive animals reacted against HEV-A and/or HEV-C, which suggests circulation of both Orthohepevirus species in urban cats and dogs in the study area. However, RNA from the Orthohepevirus species analyzed were not detected in any of the tested sera. This is the first study to assess HEV circulation in both stray cats and dogs in Europe. The results detected provide evidence of HEV exposure in sympatric urban cat and dog populations in southern Spain. In the second study (Chapter 1.2), the objective was to determine the prevalence of HEV in equine species in Andalusia (southern Spain) in order to assess the role of equids as potential reservoirs of the virus. HEV RNA was detected in sera from 0.4% (3/692) of horses, 1.2% (1/86) of donkeys and 3.6% (3/83) of mules. Phylogenetic analysis identified the zoonotic genotype 3, being closely related to viral human and swine strains. This is the first report of HEV in equids in Europe and confirm the susceptibility of horses, donkeys and mules to HEV infection. The low prevalence detected indicates that equids may be considered spillover hosts rather than true reservoirs. The aim of the third study (Chapter 1.3) was to assess the prevalence, spatial distribution and risk factors associated with HEV exposure in sheep and goats in southern Spain, the country with the highest census of small domestic ruminants in the European Union. A total of 38 (7.9%; 95%CI: 5.5–10.3) out of 480 sampled animals showed anti-HEV antibodies. By species, the seroprevalence of 13.8% (33/240; 95%CI: 9.4–18.1) found in goats was significantly higher than the 2.1% (5/240; 95%CI: 0.3–3.9) detected in sheep. Anti-HEV antibodies were found on 19 (59.4%; 95%CI: 42.4–76.4) of the 32 sampled farms. The number of small ruminants in the farm (≤348 animals and ≥538 animals) was also a risk factor potentially associated with HEV exposure in small ruminants in the study area. HEV RNA was not detected in any of the 480 (0.0%; 95%CI: 0.0–0.8) tested animals. The results obtained in this study confirm that sheep and goats are naturally, but not equally exposed to HEV and indicate the widespread spatial distribution of HEV among small ruminant populations in southern Spain. The fourth study (Chapter 2.1) analyzed the circulation of HEV in free‐ranging wild boar in the Doñana National Park, a study area characterized by very limited human activity and the absence of a pig industry. A total of 57 (57.6%; 95%CI: 47.8%–67.3%) of the 99 tested animals had anti‐HEV antibodies, indicating that this virus is widespread in wild boar in the DNP. HEV RNA was detected in one animal and phylogenetic analysis showed that the sequence isolated belonged to subtype 3r (reassigned as 3m). The results suggest a potential risk of zoonotic transmission of this novel HEV‐3 subtype and point the need to assess the role of wild boar in the epidemiology of HEV‐3m and to determine the infectivity of this emergent HEV subtype in other species, including humans. In the fifth study (Chapter 2.2) we assessed the circulation of HEV in European wild rabbits (Oryctolagus cuniculus) and Iberian hares (Lepus granatensis), the most important lagomorph species in Spanish Mediterranean ecosystems. None of the 450 lagomorphs’ livers tested positive for HEV infection. To the best of our knowledge, this is the first study to assess HEV circulation in wild rabbits in Spain and the first to evaluate HEV infection in Iberian hares. Our results indicate absence of HEV circulation in wild rabbits and Iberian hares in southern Spain during the study period, which suggests that the risk of transmission of HEV from wild lagomorphs to other species, including humans, is low. The aims of the sixth study (Chapter 2.3) were to determine the seroprevalence and prevalence of HEV in both free-living and captive populations of the Iberian lynx (Lynx pardinus), the most endangered felid in the world, as well as to evaluate potential risk factors associated with HEV exposure in this species, and the dynamics of serological markers during the study period. A total of 50 (18.2%; 95%CI: 14.1-23.2) of the 275 animals analyzed had anti-HEV antibodies by ELISA. Exposure to HEV was confirmed by WB in most of the ELISA-positive Iberian lynxes analyzed. The generalized estimating equation model identified “habitat status” (captivity) and “age” (senile, adult and subadult) in the captive population only as risk factors potentially associated with HEV exposure in the Iberian lynx. Thirteen (29.5%) of the 44 longitudinally surveyed individuals seroconverted against HEV during the study period. HEV RNA was detected in the faeces of one (1/364; 0.3%; 95% CI: 0.0-0.8) free-ranging adult animal sampled in 2021. Phylogenetic analysis showed that the sequenced strain belongs to HEV-3f subtype, which shared a high nucleotide sequence identity (97-99.6%) with human HEV-3f sequences from Spain and France. This is the first survey study on HEV in the Iberian lynx and the first molecular report of HEV-A infection in free-ranging felines. The results indicate a high exposure to HEV-3 in the Iberian lynx populations, particularly in those kept in captivity and suggest a possible role for this species as a potential spillover host of this virus. The serological results suggest the widespread but not homogeneous circulation of HEV in the Iberian lynx populations. The seventh study (Chapter 2.4) assessed HEV infection in non-human primates (NHPs) housed in zoos in Spain. Anti-HEV antibodies were found in eight (4.4%; 95%CI: 1.4–7.4) of the 181 NHPs tested and at least one seropositive animal was detected in five of the 33 species sampled (15.2%). This is the first report of seropositivity in black-and-white ruffed lemurs (Varecia variegata), common chimpanzees (Pan troglodytes), and Barbary macaques (Macaca sylvanus). Anti-HEV antibodies were found in six (75.0%) of the eight zoos included in the study. Seroconversion was detected in one chimpanzee, which confirms HEV circulation in one zoo between 2015 and 2016. Seropositivity was significantly higher in hominids than in other NHP families. HEV-A RNA was not detected in any of the serum samples tested. This study increases the host range exposed to the virus and indicate susceptibility of NHPs to HEV infection. The aims of the eighth study (Chapter 2.5) were to assess HEV exposure in captive zoo animals in Spain and to determine the dynamics of seropositivity in individuals that were sampled longitudinally during the study period. Seropositivity to HEV were detected in 36 (8.5%; 95%CI: 5.8-11.1) of 425 sampled zoo animals and antibodies against HEV-3 and/or HEV-C1 were confirmed in ELISA-positive animals using WB. Two of 46 longitudinally surveyed animals seroconverted during the study period. Seropositivity was significantly higher in carnivores and perissodactyls than in artiodactyls, and also during the period 2012-2016 compared with 2007-2011. HEV RNA was not detected in any (0.0%; 95%CI: 0.0-1.4) of the 262 animals that could be tested by RT-PCR. This is the first large-scale, long-term surveillance on HEV in different orders of zoo mammals. Our results indicate exposure to HEV-A and HEV-C in zoo animals in Spain and, together with the results of Chapter 2.4, confirm a widespread but not homogeneous spatiotemporal circulation of HEV in captive species in this country. In the ninth and last study (Chapter 2.6), the aims were to assess the seroprevalence and prevalence of HEV in both in both free-ranging and captive cetaceans in Spain and the dynamics of seropositivity in individuals sampled longitudinally during the study period. A total of 67 (49.3%; 95%CI: 40.9-57.7) out of 136 analyzed cetaceans by ELISA showed anti-HEV antibodies. Seropositivity was detected in six of the nine species sampled. Significantly higher seroprevalence was found in free-ranging (59.7%) than in captive (37.5%) cetaceans. Within the free-ranging population, the multivariate analyses identified “age” (adult) as a risk factor potentially associated with HEV exposure in cetaceans. Seroconversions were detected in two bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) during the study period. None (0.0%; 95%CI: 0.0-1.2) of the 304 analyzed cetaceans were positive for active Orthohepevirus infection. To the best of the authors’ knowledge this is the first study to assess Orthohepevirus circulation in cetaceans and to report exposure to HEV in Atlantic spotted (Stenella frontalis), Risso (Grampus griseus) and striped dolphins (Stenella coeruleoalba) as well as in Cuvier's Beaked (Ziphius cavirostris) and killer whales (Orcinus orca). Our results point high HEV exposure in cetacean populations in Spain, indicating widespread circulation of this virus in both free-ranging and captive over the last decade. This PhD thesis adds novel knowledge about the epidemiological role of animal species to HEV in different scenarios, including households, farms, Mediterranean and marine ecosystems, zoos and captivity centres. The results obtained will allow to expand the knowledge about the epidemiology of this emerging virus and to prioritize HEV monitoring and surveillance on certain animal species and epidemiological contexts.

El virus de la hepatitis E (VHE) es un patógeno emergente y zoonósico de distribución mundial que afecta a unos 20 millones de personas anualmente, siendo considerado como la principal causa de hepatitis aguda de origen viral. En países industrializados, el VHE se transmite principalmente a través del consumo de productos animales o el contacto con heces de animales infectados. Aunque el cerdo doméstico y el jabalí (Sus scrofa) son los principales reservorios de los genotipos zoonósicos del virus, la información acerca de la circulación del VHE en especies de los ecosistemas mediterráneos de la Península Ibérica es muy limitada. Asimismo, pese a que el número de hospedadores y reservorios animales ha aumentado significativamente desde su primera descripción en una especie animal en 1997, el papel en la epidemiología del VHE de especies domésticas y silvestres diferentes a los suidos es poco conocido. Por ello, la presente Tesis Doctoral tiene el objetivo principal de evaluar la circulación del VHE en especies domésticas (Capítulo 1) y silvestres (Capítulo 2), incluyendo animales de vida libre y mantenidos en cautividad, en España. Para ello se han diseñado nueve estudios que abordan cada uno de los objetivos específicos. En el primero (Capítulo 1.1), se evalúa la circulación de las especies de Orthohepevirus, incluyendo VHE-A, VHE-B y VHE-C, en perros y gatos urbanos simpátricos en el sur de España. La presencia de anticuerpos frente al VHE se detectó en un total de 19 (6,4%; IC95%: 3,6-9,2) de los 296 animales analizados por ELISA. La seropositividad fue significativamente superior en perros (9,9%; 15/152; IC95%: 5,1-14,6) que en gatos (2,8%; 4/144; IC95%: 0,1-5,5) (p=0.011). Diez de los 18 animales positivos a ELISA que pudieron ser analizados por western blot (WB), reaccionaron frente a los antígenos del VHE-A y/o VHE-C, lo cual sugiere circulación de ambas especies de Orthohepevirus en gatos y perros urbanos en el área de estudio. No se detectó ARN de ninguna especie de Orthohepevirus en ninguno de los sueros testados. Este es el primer estudio que evalúa la circulación de las diferentes especies de Orthohepevirus en gatos callejeros y perros simpátricos en Europa. Los resultados detectados muestran que las poblaciones de gatos y perros urbanos simpátricos del sur de España están expuestas al VHE. El objetivo del segundo estudio (Capítulo 1.2) fue determinar la prevalencia al VHE en especies equinas en Andalucía (sur de España) para evaluar el papel de los équidos como potenciales reservorios del virus. Se detectó ARN del VHE en muestras de suero del 0,4% (3/692) de caballos, 1,2% (1/86) de burros y 3,6% (3/83) de mulos. Los análisis filogenéticos identificaron al genotipo zoonótico 3, estando estrechamente relacionado con cepas humanas y porcinas. Ésta es la primera detección del VHE en équidos en Europa, confirmando la susceptibilidad de caballos, burros y mulos a la infección. La baja prevalencia detectada indica que los équidos podrían ser considerados como hospedadores accidentales más que como verdaderos reservorios. El tercer estudio (Capítulo 1.3) se centra en evaluar la prevalencia, distribución espacial y factores de riesgo asociados a la exposición por el VHE en ovino y caprino en el sur de España, el país con mayor censo de pequeños rumiantes en la Unión Europea. Un total de 38 (7,9%; IC95%: 5,5-10,3) de los 480 animales muestreados mostraron anticuerpos frente al VHE. Por especies, la seroprevalencia del 13,8% (33/240; IC95%: 9,4-18,1) encontrada en caprino fue significativamente superior que la del 2,1% (5/240; IC95%: 0,3-3,9) detectada en ovino. Se detectaron anticuerpos en 19 (59,4%; IC95%: 42,4–76,4) de las 32 granjas muestreadas. El censo de pequeños rumiantes en la granja (≤348 animales y ≥538 animales) fue también un factor de riesgo potencialmente asociado a la exposición por el VHE en pequeños rumiantes en el área de estudio. No se detectó ARN del VHE en ninguno de los 480 (0.0%; IC95%: 0,0-0,8) animales testados. Los resultados obtenidos en el presente estudio confirman que el ovino y el caprino están natural, pero no igualmente expuestos al virus e indican la amplia distribución espacial del VHE entre la población de pequeños rumiantes en el sur de España. El cuarto estudio (Capítulo 2.1) analiza la circulación del VHE en jabalíes en libertad en el Parque Nacional de Doñana (PND), un área caracterizada por una limitada actividad humana y la ausencia de industria porcina. Un total de 57 (57,6%; IC95%: 47,8%-67,3%) de los 99 animales testados presentaron anticuerpos frente al VHE, indicando que el virus está ampliamente distribuido en el PND. Se detectó ARN del VHE en un animal y el estudio filogenético mostró que la secuencia encontrada pertenecía al subtipo 3r (reasignado actualmente como 3m). Los resultados sugieren un potencial riesgo de transmisión zoonótica de este nuevo subtipo de VHE-3 y señala la necesidad de evaluar el papel del jabalí en la epidemiología del VHE-3m y determinar la capacidad infectiva de este subtipo emergente en otras especies, incluido seres humanos. En el quinto estudio (Capítulo 2.2) se evalúa la circulación del VHE en conejo silvestre (Oryctolagus cuniculus) y liebre ibérica (Lepus granatensis), las dos especies de lagomorfos más importantes en los ecosistemas mediterráneos españoles. Ninguno de los 450 hígados de los lagomorfos analizados fueron positivos a la infección por VHE. Desde nuestro conocimiento, este es el primer estudio que evalúa la circulación del virus en conejo silvestre en España y el primero en liebre ibérica en todo el mundo. Nuestros resultados indican ausencia de circulación del VHE en conejo silvestre y liebre ibérica en el sur de España durante el período de estudio, sugiriendo que el riesgo de transmisión del VHE desde los lagomorfos silvestres a otras especies, incluidos los humanos, es bajo. Los objetivos del sexto estudio (Capítulo 2.3) fueron determinar la seroprevalencia y prevalencia del VHE en las poblaciones en libertad y cautividad de lince ibérico (Lynx pardinus), el felino más amenazado del mundo, así como evaluar los principales factores de riesgo asociados a la exposición al virus en esta especie y la dinámica de marcadores serológicos durante el período de estudio. Un total de 50 (18,2%; IC95%: 14,1-23,2) de los 275 animales analizados presentaron anticuerpos frente al VHE por ELISA. Se confirmó la exposición al virus por WB en la mayoría de los linces positivos a ELISA. El modelo de ecuación de estimación generalizada identificó el “hábitat” (cautividad) y la “edad” (senil, adulto y subadulto) dentro de la población cautiva como factores de riesgo potencialmente asociados a la exposición al VHE en lince ibérico. Trece (29,5%) de los 44 animales longitudinalmente muestreados seroconvirtieron durante el período de estudio. Se detectó ARN del VHE en las heces de un (1/364; 0,3%; IC95%: 0,0-0,8) lince adulto en libertad muestreado en 2021. El análisis filogenético identificó que la secuencia obtenida pertenece al subtipo VHE-3f, compartiendo una alta homología (97-99,6%) con cepas humanas de VHE-3f de España y Francia. Este es el primer estudio de VHE en lince ibérico y la primera detección molecular de VHE-A en felinos de vida libre. Los resultados indican una elevada exposición al VHE-3 en las poblaciones de lince ibérico, particularmente en las mantenidas en cautividad, y sugiere un posible papel como hospedador accidental. Los resultados serológicos sugieren una amplia pero no homogénea circulación del virus en las poblaciones de lince ibérico. El séptimo estudio (Capítulo 2.4) evalúa la infección por VHE en primates no humanos (PNHs) de parques zoológicos en España. Se observaron anticuerpos frente al virus en ocho (4,4%; IC95%: 1,4-7,4) de los 181 PNHs testados y se encontró al menos un animal seropositivo en cinco (15,2%) de las 33 especies muestreadas. Esta es la primera detección de seropositividad en lémur rufo blanco y negro (Varecia variegata), chimpancé común (Pan troglodytes), y macaco de Berbería (Macaca sylvanus). Seis (75,0%) de los ocho zoológicos incluidos en el estudio alojaban animales con anticuerpos frente al VHE. Se detectaron seroconversiones en un chimpancé, confirmando circulación del virus en un zoo entre 2015 y 2016. La seropositividad fue significativamente superior en homínidos que en otras familias de PNHs. No se encontró ARN del VHE-A en ninguna de las muestras de suero testadas. Este estudio aumenta el rango de hospedadores expuestos al virus y señala la susceptibilidad de PNHs a la infección por el VHE. Los objetivos del octavo estudio (Capítulo 2.5) fueron evaluar la exposición al VHE en animales de zoológico en España y determinar la dinámica de seropositividad en individuos longitudinalmente muestreados durante el período de estudio. Se detectó seropositividad en 36 (8,5%; IC95%: 5,8-11,1) de los 425 animales analizados y se confirmaron anticuerpos frente al VHE-A y/o VHE-C en animales positivos a ELISA mediante WB. Dos de los 46 individuos longitudinalmente muestreados seroconvirtieron durante el periodo de estudio. La seroprevalencia fue significativamente superior en carnívoros y perisodáctilos que en artiodáctilos, y durante el período 2012-2016 comparado con el de 2007-2011. No se detectó ARN de Orthohepevirus en ninguno (0,0%; IC95%: 0,0-1,4) de los 262 animales que pudieron ser testados por RT-PCR. Este es el primer estudio a gran escala y largo plazo de VHE en diferentes órdenes de mamíferos en zoológicos. Nuestros resultados indican exposición al VHE-A y VHE-C en animales de zoo en España y, junto con los resultados del Capítulo 2.4, confirman una amplia pero no homogénea circulación espaciotemporal del VHE en especies cautivas en este país. En el noveno y último estudio (Capítulo 2.6), se determinó la seroprevalencia y prevalencia del VHE en las poblaciones de vida libre y cautivas de cetáceos en España, así como la dinámica de seropositividad en individuos longitudinalmente muestreados durante el periodo de estudio. Un total de 67 (49,3%; IC95%: 40,9-57,7) de los 136 cetáceos analizados por ELISA presentaron anticuerpos frente al VHE. Se detectó seropositividad en seis de las nueve especies analizadas serológicamente. Los cetáceos en libertad (59,7%) presentaron una seroprevalencia significativamente superior que los mantenidos en cautividad (37.5%). Dentro de la población de cetáceos en libertad, se identificó la “edad” (adulto) como un factor de riesgo potencialmente asociado a la exposición por el VHE. Se observaron seroconversiones en dos delfines mulares (Tursiops truncatus) durante el período de estudio. Ninguno (0,0%; IC95%: 0,0-1,2) de los 304 cetáceos analizados fue positivo a infección activa por Orthohepevirus. Desde el conocimiento de los autores, este es el primer estudio que evalúa la circulación de Orthohepevirus en cetáceos y en detectar exposición al VHE en el delfín moteado del Atlántico (Stenella frontalis), delfín listado (Stenella coeruleoalba), calderón gris (Grampus griseus), ballenato de Cuvier (Ziphius cavirostris) y orca (Orcinus orca). Nuestros resultados señalan una elevada exposición al VHE en las poblaciones de cetáceos en España e indican una circulación espaciotemporal endémica de este virus en cetáceos de vida libre y cautividad durante la última década. Esta Tesis Doctoral aporta nuevos conocimientos acerca del papel epidemiológico de especies animales en diferentes escenarios, incluidos casas, explotaciones, ecosistemas mediterráneos y marinos, zoológicos, así como en otros centros de cautividad. Los resultados obtenidos permitirán mejorar el conocimiento sobre la epidemiología de este virus emergente y priorizar la monitorización y vigilancia del VHE en ciertas especies animales y en determinados contextos epidemiológicos.