Contribución del Power Doppler para predecir la funcionalidad endocrina ovárica en yeguas Pura Raza Española

Abstract

Introducción: Esta tesis doctoral ha sido desarrollada gracias al contrato mediante articulo 83 formalizado entre la Yeguada Miguel A. de Cárdenas (Écija, Sevilla) y los directores de esta tesis doctoral del grupo de investigación AGR-019 “Fisiovet” de la Universidad de Córdoba. La yegua es un animal poliéstrico estacional en la que los procesos reproductivos se ven afectados por cambios estacionales en el fotoperiodo, siendo su ciclo de días largos, es decir en primavera-verano cuando ocurre el pico de la función ovárica. La ovulación de las yeguas se produce a intervalos de 21 días aproximadamente, durante la época reproductiva, 24 o 48 horas antes del final del estro. El final del estro, se ve reflejado en un aumento en los niveles de progesterona (P4), la cual es secretada por el cuerpo lúteo (CL). El control reproductivo en las yeguas y la predicción de la funcionalidad ovárica son de suma importancia para el éxito de una ganadería equina. Con la técnica ecográfica modo B, podemos monitorizar la dinámica folicular, así como la ovulación y la posterior área y ecogenicidad del cuerpo lúteo. En reproducción equina, es importante conocer con precisión el momento de la ovulación, para que el depósito del semen se realice lo más cerca posible del momento de la liberación del ovocito, así como la funcionalidad del cuerpo lúteo para evitar reabsorciones de la vesícula embrionaria por falta de secreción de progesterona. La ultrasonografía Power Doppler es una técnica que ha demostrado tener un potencial añadido que permite mejorar las capacidades de diagnóstico al ser una técnica no invasiva, que permite evaluar flujo sanguíneo y vascularización de un órgano objetivo. Para realizar un estudio en profundidad del ovario, una herramienta útil para evaluar la actividad del CL es la determinación de la concentración de P4. En consecuencia, la relación de la FSCL con la concentración de progesterona podrían ser un modelo predictivo para estimar la funcionalidad de la CL evitando situaciones de estrés para los animales, proporcionando un buen pronóstico y mejorando el cuidado de las yeguas y su gestión práctica. La ultrasonografía Power Doppler podría contribuir a la mejora de la gestión reproductiva de los equinos, consiguiendo un mejor aprovechamiento del material genético y aumentando el rendimiento económico. Objetivos: El objetivo general de esta investigación fue utilizar la técnica ultrasonográfica power-doppler para la funcionalidad ovárica, así mismo como predictor temprano de gestación en la yegua Pura Raza Española para que pueda ser de aplicada en la práctica clínica de reproducción equina. Objetivos específicos: Primero: Determinar mediante ultrasonografía modo B medidas morfométricas (diámetro-área) y mediante power-doppler el flujo hemodinámico de los folículos preovulatorios y de la funcionalidad del posterior cuerpo lúteo que formen en distintos grupos de edad. Segundo: Evaluar la influencia de la edad en parámetros ultrasonográficos (diámetro folicular, flujo sanguíneo folicular, área del cuerpo lúteo y flujo sanguíneo del cuerpo lúteo) y las concentraciones de progesterona. Tercero: Caracterización de la perfusión vascular uterina a través de los índices de pulsatibilidad y resistencia como predictores tempranos de gestación. Hipótesis: Para ello nos planteamos como hipótesis que las estructuras ováricas como folículos preovulatorios y cuerpos lúteos deben de tener una perfusión sanguínea adecuada para su fisiología endocrina al secretar hormonas. Si medimos con una técnica no invasiva como la ecografía doppler el riego sanguíneo de la mismas, aparte de su diámetros y áreas, y analizamos las hormonas en plasma mediante un ensayo por inmuno absorción ligado a enzimas, conocido como ELISA, podremos establecer una ecuación de regresión que permita predecir la concentración hormonal únicamente con una ecografía ovárica. Así mismo, la medición de los índices de pulsatibilidad y resistencia uterinos deben de variar tanto con la edad como con la gestación, y se podrían emplear como predictores tempranos de gestación. Metodología: En la metodología de nuestro trabajo se evaluaron 30 yeguas de Pura Raza Española con un rango de edad entre 4 y 19 años (con un promedio de 9,3) y un peso que oscilo entre los 600 y 700 kg, con una condición corporal mínima de 8. Todas las yeguas tenían un tracto reproductivo normal, una duración típica de los ciclos estrales, estaban libres de enfermedades infecciosas y se alojaron en establos con acceso ab libitum al agua, heno y sal mineral. Las yeguas, con el fin de poder valorar el efecto de la edad, se dividieron en dos grupos: jóvenes (<8 años, n = 15) y maduras (>8 años, n = 15). La fase experimental se llevó a cabo en la ganadería “Miguel Ángel de Cárdenas”, ubicada en la Finca San Pablo (Écija, Sevilla, España). El manejo se hizo siguiendo los requisitos exigidos por la Universidad de Córdoba sobre bienestar y experimentación animal. Todas las yeguas de este estudio se sometieron a un examen clínico general y ginecológico previo para descartar posibles patologías reproductivas y determinar el momento del ciclo en el que se encontraban. Mediante ecografía se comprobó que estuvieran en celo con un folículo preovulatorio de 35 mm de diámetro o superior, así como edema endometrial, y mediante palpación rectal se comprobó que tuvieran tono cervical. Posteriormente se les administro vía intravenosa una dosis de 3000 UI de hCG (VETERIN CORIONR) para la inducción de la ovulación. En todas ellas, la ovulación se registró entre las 24 y las 48 h posteriores a la administración de la hCG mediante ecografía. La inseminación artificial se realizó con semen refrigerado obtenido de sementales de la propia yeguada. Se realizo un examen minucioso y en profundidad de los ovarios y el útero de cada una de las yeguas para conseguir una interpretación correcta de la dinámica folicular. Las imágenes power doppler grabadas se tomaron de yeguas con folículos preovulatorios de 35 mm que coincidían con la administración de hCG (inducción de la ovulación). Se asumió el tiempo de ovulación entre 24 y 48 h después de la administración de hCG. El examen ecográfico del CL fue realizado entre los 5-6 días post-ovulación y se obtuvieron muestras de sangre para el análisis de progesterona. Junto con el examen de ambos ovarios, también se registraron imágenes del útero para un análisis más completo de la perfusión vascular uterina. Se llevo a cabo la medición de los índices PI/RI de la arteria uterina, con el registro de al menos dos ciclos cardiacos consecutivos. Así mismo se realizó el diagnostico de gestación y la medición de los índices PI/RI de la arteria uterina de nuevo a los 14 días. Se realizo un estudio estadístico de los resultados obtenidos, obteniendo los estadísticos básicos de las mediciones realizadas, análisis de varianza y grado de significación, además de correlaciones entre los mismos. Resultados: Para los parámetros: diámetro de folículo preovulatorio (mm), flujo sanguíneo del folículo preovulatorio (%), área del cuerpo lúteo (mm), flujo sanguíneo del cuerpo lúteo (%), y progesterona (ng/mL) fueron mayores en las jóvenes que en las maduras. Con respecto a la edad se apreciaron correlaciones positivas (p ≤0.05) con el flujo sanguíneo del folículo preovulatorio; así mismo, se encontraron correlaciones negativas (p ≤0,05) para el diámetro del folículo preovulatorio y el flujo sanguíneo del cuerpo lúteo y una fuerte correlación negativa (p ≤0,01) con la progesterona. El flujo sanguíneo del cuerpo lúteo presenta correlaciones muy significativas y positivas (p ≤0,01) con el área del cuerpo lúteo y la concentración de progesterona. Sin embargo, esta correlación es negativa a medida que aumenta la edad (mayores de 8 anos). En todas las yeguas incluidas en este estudio no existe correlación significativa del flujo sanguíneo del folículo preovulatorio, ni del diámetro del folículo preovulatorio ni tampoco del área del cuerpo lúteo con las demás variables analizadas. En el presente estudio, se encontró que el flujo sanguíneo del cuerpo lúteo es un predictor moderadamente bueno de niveles de progesterona. Estos resultados apoyarían el interés en Power Doppler como un método no invasivo, técnica para cuantificar los niveles plasmáticos de progesterona en yeguas cíclicas, mediante la recta de regresión lineal propuesta a partir del flujo sanguíneo del cuerpo lúteo. Se obtuvo que para las yeguas jóvenes el PI y RI fueron más bajos que en las maduras, sin influencia de la gestación. En las yeguas preñadas, los valores de PI y RI desciende de forma más rápida en el grupo de jóvenes que en el de maduras, apreciándose que a medida que avanzaba la gestación había una disminución progresiva de PI y RI. Conclusiones: Las conclusiones obtenidas en la presente tesis doctoral fueron las siguientes: Primera: El Power Doppler tiene un enorme potencial para evaluar la hemodinámica ovárica y utilizada en conjunto con la ecografía convencional (modo B) podrá contribuir al perfeccionamiento del manejo reproductivo equino diario, al ser muy útil para evaluar la funcionalidad del cuerpo lúteo, obteniendo mejor aprovechamiento del material genético y mejorando los rendimientos reproductivos. Segunda: Los niveles plasmáticos de progesterona se pueden predecir a partir del flujo sanguíneo del cuerpo lúteo utilizando la técnica ecográfica de Power Doppler, aplicando rectas de regresión, y reduciendo el coste económico de la medición de esta hormona laboratorialmente. Tercera: Nuestros resultados apoyan que la edad es un factor que influye significativamente en la perfusión sanguínea folicular y del cuerpo lúteo así como la concentración plasmática de progesterona en yeguas. Se necesitan más estudios para mejorar la precisión y exactitud de tales predicciones. Cuarta: Los índices PI/RI obtenidos mediante Doppler pulsado se pueden utilizar como predictor prematuro de la gestación, estos son siempre más bajos en yeguas jóvenes, y bajan significativamente en las yeguas gestantes, pudiéndose aplicar a la obtención de embriones para su transferencia y/o recolección para su criopreservación.

Introduction: This investigation has been developed thanks to the contract by means of article 83 formalized between Miguel A. de Cardenas Stud Farm (Ecija, Seville) and the directors of this doctoral thesis belong to the research group AGR-019 "Fisiovet" of the University of Cordoba. The mare is a seasonal polyestrous animal in which the reproductive processes are affected by seasonal changes in the photoperiod, being its cycle of long days, i.e. in spring-summer when the peak of the ovarian function occurs. Ovulation in mares occurs at approximately 21-day intervals during the breeding season, 24 to 48 hours before the end of oestrus. The end of oestrus is reflected in increased levels of progesterone (P4), which is secreted by the corpus luteum (CL). Reproductive monitoring in mares and the prediction of ovarian functionality are of utmost importance for the success of an equine farm. With the B-mode ultrasound technique, we can monitor follicular dynamics as well as ovulation and subsequent corpus luteum area and echogenicity. In equine reproduction, it is important to precisely know the moment of ovulation, so that the semen is deposited as close as possible to the moment of oocyte release, as well as the functionality of the corpus luteum to avoid reabsorption of the embryonic vesicle due to lack of progesterone secretion. Power Doppler ultrasonography is a technique that has been shown to have an added potential to improve diagnostic capabilities as it is a non-invasive technique that allows blood flow and vascularization of a target organ to be assessed. For an in-depth study of the ovary, a useful tool to assess the activity of the LC is the determination of P4 concentration. Consequently, the relationship of FSCL with progesterone concentration could be a predictive model to estimate the functionality of the CL avoiding stressful situations for the animals, providing a good prognosis and improving the mares' care and practical management. Power Doppler ultrasonography could contribute to the improvement of equine reproductive management, achieving a better use of genetic material and increasing economic performance. Objectives: The general objective of this research was to use the power-doppler ultrasonographic technique for ovarian functionality, as well as an early predictor of gestation in the Pura Raza Espanola mare so that it can be applied in the clinical practice of equine reproduction. Specific objectives: First: To determine by B-mode ultrasonography morphometric measurements (diameter-area) and by power-Doppler the haemodynamic flow of the pre-ovulatory follicles and the functionality of the subsequent corpus luteum that they form in different age groups. Second: To evaluate the influence of age on ultrasonographic parameters (follicular diameter, follicular blood flow, corpus luteum area and corpus luteum blood flow) and progesterone concentrations. Third: Characterization of uterine vascular perfusion through pulsation and resistance indices as early predictors of gestation. Hypothesis: We hypothesize that ovarian structures such as pre-ovulatory follicles and corpora lutea must have adequate blood perfusion for their endocrine physiology when secreting hormones. If we measure with a non-invasive technique such as Doppler ultrasound the blood supply of these structures, apart from their diameters and areas, and analyses the hormones in plasma using an enzyme-linked immunosorbent assay, known as ELISA, we can establish a regression equation that allows us to predict the hormone concentration only with an ovarian ultrasound, and the measurement of the uterine pulsation and resistance indices should vary with both age and gestation, and could be used as early predictors of gestation. Methodology: In the methodology of our work, 30 Pura Raza Espanola mares were evaluated with an age range between 4 and 19 years (with an average of 9.3) and a weight ranging between 600 and 700 kg, with a minimum body condition of 8. All mares had a normal reproductive tract, a typical length of oestrous cycles, were free of infectious diseases and were housed in stables with ab libitum access to water, hay and mineral salt. The mares, in order to be able to assess the effect of age, were divided into two groups: young (<8 years, n = 15) and mature (>8 years, n = 15). The experimental phase was carried out at the "Miguel Angel de Cardenas" livestock farm, located at Finca San Pablo (Ecija, Seville, Spain). The management was done following the requirements of the University of Cordoba on animal welfare and experimentation. All the mares in this study underwent a general clinical and gynaecological examination beforehand to rule out possible reproductive pathologies and to determine the time of their cycle. Ultrasonography was used to check that they were in oestrus with a pre-ovulatory follicle of 35 mm in diameter or greater, as well as endometrial oedema, and rectal palpation was used to check that they had cervical tone. Subsequently, a dose of 3000 IU of hCG (VETERIN CORIONR) was administered intravenously to induce ovulation. In all of them, ovulation was recorded between 24 and 48 h after hCG administration by ultrasound. Artificial insemination was performed with refrigerated semen obtained from the stud's own stallions. A thorough and in-depth examination of the ovaries and uterus of each of the mares was performed to obtain a correct interpretation of the follicular dynamics. The recorded power doppler images were taken from mares with pre-ovulatory follicles of 35 mm coinciding with the administration of hCG (ovulation induction). Ovulation time was assumed to be between 24 and 48 h after hCG administration. Ultrasound examination of the CL was performed 5-6 days post-ovulation and blood samples were obtained for progesterone analysis. Along with the examination of both ovaries, images of the uterus were also recorded for a more complete analysis of uterine vascular perfusion. Measurement of the PI/RI indices of the uterine artery was performed, with recording of at least two consecutive cardiac cycles. Diagnosis of gestation and measurement of the PI/RI indices of the uterine artery was performed again after 14 days. A statistical study of the results obtained was carried out, obtaining the basic statistics of the measurements taken, analysis of variance and degree of significance, as well as correlations between them. Results: For the parameters: preovulatory follicle diameter (mm), preovulatory follicle blood flow (%), corpus luteum area (mm), corpus luteum blood flow (%), and progesterone (ng/mL) were higher in young women than in mature women. With respect to age, positive correlations (p ≤0.05) were found with pre-ovulatory follicle blood flow; negative correlations (p ≤0.05) were found for pre-ovulatory follicle diameter and corpus luteum blood flow and a strong negative correlation (p ≤0.01) with progesterone. Corpus luteum blood flow has highly significant and positive correlations (p ≤0.01) with corpus luteum area and progesterone concentration. However, this correlation becomes negative with increasing age (older than 8 years). In all mares included in this study, there is no significant correlation of pre-ovulatory follicle blood flow, pre-ovulatory follicle diameter and corpus luteum area with the other variables analyzed. In the present study, corpus luteum blood flow was found to be a moderately good predictor of progesterone levels. These results would support the interest in Power Doppler as a non-invasive method, technique to quantify plasma progesterone levels in cyclic mares, using the proposed linear regression line from corpus luteum blood flow. It was obtained that for young mares the PI and RI were lower than in mature mares, without influence of gestation. In pregnant mares, PI and RI values fell more rapidly in the young group than in the mature group, with a progressive decrease in PI and RI as gestation progressed. Conclusions: The conclusions obtained in the present doctoral thesis were as follows: First: Power Doppler has an enormous potential to evaluate ovarian haemodynamics and used in conjunction with conventional ultrasound (B-mode) could contribute to the improvement of daily equine reproductive management, as it is very useful to evaluate the functionality of the corpus luteum, obtaining better use of genetic material and improving reproductive performances. Second: Plasma progesterone levels can be predicted from corpus luteum blood flow using the Power Doppler ultrasound technique, applying regression lines, and reducing the economic cost of measuring this hormone laboratorially. Third: Our results support that age is a significant factor influencing follicular and corpus luteum blood perfusion and plasma progesterone concentration in mares. Further studies are needed to improve the precision and accuracy of such predictions. Fourth: PI/RI indices obtained by pulsed Doppler can be used as an early predictor of gestation, they are always lower in young mares, and drop significantly in pregnant mares, and can be applied to embryo procurement for transfer and/or collection for cryopreservation.