Análisis toxicológico de drogas farmacéuticas e ilícitas en agresiones sexuales facilitadas por drogas por LCMS/ MS usando biodisolventes supramoleculares

Abstract

The research carried out in this doctoral thesis focused on the development of an innovative and eco-friendly extraction method for the qualification and quantification of multi-class drugs involved in drug-facilitated sexual assaults (DFSA) from several biological matrices using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The extraction method was based on the use of supramolecular solvents (SUPRASs) and the target compounds included benzodiazepines, z-hypnotic drugs, amphetamine derivatives, cocaine and its metabolites and other miscellaneous compounds that are frequently used in DFSA. The developed green extraction method was applied to two biological matrices: liquid biological sample (urine) in chapter II and a solid biological sample (hair) in chapter III. In the Introduction, a general overview on the DFSA cases and involved compounds was reported, then the principle of green chemistry and the available extraction techniques used in forensic toxicology filed, and finally, the need of developing extraction method that allows the green analysis using SUPRASs was discussed. The results and discussion section starts with a review article (Chapter I) discussing the analysis of conventional and nonconventional forensic specimens in DFSA by LC-MS/MS. This review article provides a critical illustration about the DFSA in the last 10 years including the most common drugs reported in literature from different countries around the world and their prevalence. The review concluded that alcohol alone or in combination with a variety of pharmaceutical and illegal drugs (e.g., benzodiazepines, z-hypnotics drugs, cannabinoids, or cocaine) is still on top in the DFSA cases reported around the world. Moreover, the article reviewed the selection requirement of the appropriate biological samples and the increased use of the nonconventional samples (hair, vitreous humor, etc.) in such investigations. It is pointed out in the review that although liquid-liquid extraction (LLE) and solid-phase extraction (SPE) are the most often used extraction procedures, there is a growing interest in the development of microextraction formats and dilute and shoot tactics. Although GCMS is still employed in forensic routine analysis, LC-MS/MS (both low and highresolution MS) has been established as a more ideal alternative for multiple drug analysis due to its high sensitivity, specificity, and lack of the necessity for derivatization. Chapter II was performed to develop an innovative, green, and effective technique for extracting specific DFSA compounds from human urine using SUPRASs. The method has been optimized and validated for the extraction of 23 targeted-DFSA substances. The SUPRAS extraction process, which involves stirring, centrifugation, and dilution, is simple, quick, and environmentally friendly. The extracted SUPRAS samples are then analyzed using LC-MS/MS. The study demonstrates that the proposed extraction method has a high extraction efficiency ranging from 79% to 119% for many target compounds. Matrix effects are found to be tolerable for most compounds. Additionally, the method achieves low detection and quantification limits, surpassing the minimal performance requirements for these compounds. These findings indicate that the SUPRAS-based extraction technique holds great promise for monitoring illicit substances in DFSA cases within forensic laboratories. After investigating the SUPRAS extraction technique to liquid biological samples (urine), the efficiency of SUPRAS method was planned to be studied on solid biological samples (hair). For this reason, the third section (Chapter III) discusses the development and validation of a single-step extraction method for analysing DFSA compounds in hair samples. Overall, the SUPRAS-based method offers several advantages, including its green and eco-friendly nature, simplified extraction process, increased sensitivity, broad compound coverage, high extraction efficiency, and practical applicability in real forensic sexual assault cases. At the end of the thesis, the most relevant conclusions of the chapters are pointed out in the Conclusion section. Finally, in the Annexes, the informed consent for extraction, use and storage of biological samples, as well as the communications presented at scientific conferences, are included.

La investigación llevada a cabo en esta tesis doctoral se centró en el desarrollo de un método de extracción innovador y respetuoso con el medio ambiente para la identificación y cuantificación de fármacos de múltiples clases involucrados en agresiones sexuales facilitadas por drogas (DFSA) a partir de diversas matrices biológicas, utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LCMS/ MS). El método de extracción se basó en el uso de disolventes supramoleculares (supramolecular solvents, SUPRASs) y las drogas seleccionadas incluyeron benzodiacepinas, fármacos hipnóticos tipo Z, derivados de anfetaminas, cocaína y sus metabolitos, y otros compuestos diversos que se utilizan con frecuencia en casos de DFSA. El método de extracción desarrollado se aplicó a dos matrices biológicas: muestra biológica líquida (orina) en el capítulo II y muestra biológica sólida (pelo) en el capítulo III. En la Introducción se presenta una visión general de los casos de DFSA y los compuestos involucrados, a continuación, se aborda el principio de la química verde y las técnicas de extracción disponibles utilizadas en el campo de la toxicología forense, y finalmente se discute la necesidad de desarrollar métodos de extracción más sostenibles. La sección de resultados y discusión comienza con un artículo de revisión (Capítulo I), que trata sobre el análisis de muestras forenses convencionales y no convencionales en casos de DFSA mediante LC-MS/MS. Este artículo de revisión proporciona una revisión crítica sobre los casos de DFSA en los últimos 10 años, incluyendo los fármacos más comunes reportados en la literatura de diferentes países de todo el mundo y su prevalencia. La revisión concluyó que el alcohol solo o en combinación con una variedad de fármacos farmacéuticos e ilegales (por ejemplo, benzodiacepinas, fármacos hipnóticos tipo Z, cannabinoides o cocaína) sigue siendo el más común en los casos de DFSA reportados en todo el mundo. Además, el artículo revisó los requisitos de selección de la muestra biológica apropiada en DFSA y el aumento en el uso de muestras no convencionales (pelo, humor vítreo, etc.) en tales investigaciones. Se señala en la revisión que, aunque la extracción líquido-líquido (LLE) y la extracción en fase sólida (SPE) son los procedimientos de extracción más utilizados, existe un creciente interés en el desarrollo de formatos de microextracción y tácticas. de dilución y análisis directo. Aunque la GC-MS todavía se utiliza en el análisis forense de rutina, la LC-MS/MS (tanto en MS de baja como de alta resolución) se ha establecido como una alternativa más ideal para el análisis de múltiples fármacos debido a su alta sensibilidad, especificidad y la falta de necesidad de derivatización. En el Capítulo II se desarrolló una técnica innovadora, ecológica y efectiva para extraer compuestos específicos de DFSA de la orina humana utilizando SUPRASs. El método ha sido optimizado y validado para la extracción de 23 sustancias específicas de DFSA. El proceso de extracción con SUPRASs, que incluye agitación, centrifugación y dilución, es simple, rápido y respetuoso con el medio ambiente. Las muestras de SUPRAS extraídas se analizan directamente utilizando LC-MS/MS. El estudio demuestra que el método de extracción propuesto tiene una alta eficiencia de extracción que oscila entre el 79% y el 119% para muchos compuestos objetivo. Los efectos de matriz se consideran tolerables para la mayoría de los compuestos. Además, el método alcanza límites de detección y cuantificación bajos, superando los requisitos mínimos de rendimiento para estos compuestos. Estos hallazgos indican que la técnica de extracción basada en SUPRAS es eficaz y respetuosa con el medio ambiente y tiene un gran potencial para detectar y cuantificar sustancias ilícitas en casos de DFSA en laboratorios forenses. Después de investigar el uso de la técnica de extracción SUPRAS en muestras biológicas líquidas (orina), se planeó estudiar la eficiencia del método SUPRAS en muestras biológicas sólidas (pelo). Por esta razón, la tercera sección (Capítulo III) trata sobre el desarrollo y la validación de un método de extracción para analizar compuestos de DFSA en muestras de pelo que consta de una única etapa. En general, el método basado en SUPRAS ofrece varias ventajas, incluyendo su naturaleza ecológica, proceso de extracción simplificado, mayor sensibilidad, amplia cobertura de compuestos, alta eficiencia de extracción y aplicabilidad en casos forenses reales de agresión sexual. Al final de la tesis, se destacan las conclusiones más relevantes de las investigaciones presentadas en los diferentes capítulos en la sección de Conclusiones. Finalmente, en los anexos, se incluyen el consentimiento informado para la extracción, uso y almacenamiento de muestras biológicas, así como las comunicaciones presentadas en conferencias científicas.