Quantitative proteomics in the bioremediation of cyanide, arsenic and metals by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344

Abstract

Proteomics is a high-throughput and relatively new technology that has gained a lot of interest during last decades. Proteomics belongs to the family of “omics” techniques together with genomics, transcriptomics and metabolomics, among others, and it aims to investigate the functional relevance of all expressed proteins in cells, tissues or organisms, providing a holistic view. Despite its broad applications in clinical field, the proteomics studies focused on microbial bioremediation of wastewaters and soils contaminated with toxic pollutants remain scarce. Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 is a cyanotrophic Gram-negative bacterium isolated form sludges of Guadalquivir River that is able to use free cyanide, metal-cyanide complexes and cyano-derivatives as sole nitrogen source under alkaline conditions, thus preventing the formation of highly toxic cyanhydric acid. P. pseudoalcaligenes CECT 5344 is a versatile organism with great biotechnological potential in bioremediation treatments. Intense industrial and mining activities generate large amounts of wastes that usually are rich in arsenic, mercury, and cyanide. In this work the quantitative proteomic liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (LCMS/ MS) technique complemented with transcriptional quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis has been used to unravel the molecular mechanisms triggered by the simultaneous presence of toxic compounds in the cyanide-assimilating bacterium P. pseudoalcaligenes CECT 5433. Firstly, the combined effect of arsenic and cyanide on the metabolism of the strain CECT 5344 was investigated. Several proteins encoded by two ars gene clusters of this bacterium, as well as other As-related proteins, were induced by the presence of arsenic. The nitrilase NitC, required for cyanide assimilation was found unaffected in the analysis, thereby allowing bacterial growth with both cyanide and arsenic. The expression of ArsH2 protein increased in the presence of arsenite or cyanide, suggesting its role in the protection from oxidative stress caused by both toxics. Tetrahydrofolate metabolism was also stimulated by arsenite. Finally, two As-resistance mechanisms were characterized in the strain CECT 5344, the extrusion of As(III) and its extracellular sequestration in biofilm, whose synthesis increased in the presence of arsenite, and the formation of organoarsenicals such as arsenophosphoglycerate and methyl-As. Subsequently, the proteomic approach has been applied to disclose the molecular basis of the detoxification of cyanide and mercury by P. pseudoalcaligenes CECT 5344. This bacterium harbors two mer gene clusters, whose expression was stimulated by the presence of mercury chloride. The cyanideinsensitive alternative oxidase CioAB and the nitrilase NitC were not significantly affected by Hg, thus highlighting their importance in the tolerance and assimilation of cyanide in the presence of this heavy metal. The CECT 5344 strain demonstrated significantly higher mercury resistance when the bacterium was grown with cyanide than with ammonium, probably due to the formation of cyanide-mercury complexes. Furthermore, the integration of proteomic, bioinformatic and transcriptional data suggested a potential role of the MerR2 protein as a master regulator in media with cyanide and mercury. In general, the Hg-resistance mechanism in the CECT 5344 strain was based on the activity of mercuric reductase MerA and the extrusion from the cells of the volatile form Hg0, with a residual accumulation inside the cells, probably through chelation to biomolecules. Finally, a quantitative proteomic LC-MS/MS analysis was also applied to characterize the metabolic changes in P. pseudoalcaligenes CECT 5344 during an anaerobic lifestyle in a presence of iron and ammonium. The proteomic analysis revealed induction under anoxic conditions of proteins associated with the tricarboxylic acid cycle, fatty acid metabolism, polyhydroxyalkanoates metabolism, as well as iron-related proteins, among others. It is suggested that ammonium, in addition to acting as a N-source, participates in the Fe(III) reduction via the Fe-dependent ammonium oxidation (Feammox) process, and the respiratory electron transport chain of this bacterium would be involved in the regeneration of Fe(III) from Fe(II) for the Feammox reaction coupled to fumarate respiration. Additionally, the excess of carbon source was directed into synthesis of polyhydroxyalkanoates. These results are a preliminary view on the anaerobic metabolism of the strain CECT 5344, which requires further studies to corroborate this hypothesis. In general, all the results presented in this work highlight the great and versatile biotechnological potential of the cyanotrophic bacterium P. pseudoalcaligenes CECT 5344, and could be useful not only for the design of strategies for bioremediation of complex industrial wastes cocontaminated with cyanide, arsenic, and mercury, but also for the development of alternative anaerobic technologies.

La proteómica es una tecnología de alto rendimiento y relativamente nueva que ha adquirido mucho interés durante las últimas décadas. La proteómica pertenece a la familia de las técnicas “ómicas” junto con la genómica, la transcriptómica y la metabolómica, y tiene como objetivo investigar la relevancia funcional de todas las proteínas expresadas en células, tejidos u organismos, aportando una visión holística. A pesar de sus amplias aplicaciones en el campo clínico, los estudios de proteómica centrados en la biorremediación microbiana de aguas residuales y suelos contaminados con sustancias tóxicas siguen siendo escasos. Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 es una bacteria Gram-negativa aislada de los lodos del río Guadalquivir que es capaz de utilizar cianuro libre, complejos metal-cianuro y cianoderivados como única fuente de nitrógeno en condiciones alcalinas, lo que evita la formación de ácido cianhídrico volátil. P. pseudoalcaligenes CECT 5344 es un organismo versátil con gran potencial biotecnológico para su aplicación en tratamientos de biorremediación. Las intensas actividades industriales y mineras generan grandes cantidades de residuos que suelen ser ricos en cianuro, arsénico, mercurio y otros metales. En este trabajo se ha utilizado la proteómica cuantitativa (LC-MS/MS) complementada con análisis transcripcional mediante qRT-PCR para dilucidar los mecanismos moleculares desencadenados por la presencia simultánea de compuestos tóxicos en la bacteria asimiladora de cianuro P. pseudoalcaligenes CECT 5433. En primer lugar, se investigó el efecto combinado del arsénico y el cianuro sobre el metabolismo de la cepa CECT 5344. Varias proteínas codificadas por dos agrupaciones de genes ars, así como otras proteínas relacionadas con la tolerancia al As, resultaron inducidas por la presencia de arsénico. La nitrilasa NitC, necesaria para la asimilación del cianuro, no se vio afectada en el análisis, lo que permitió el crecimiento bacteriano tanto con cianuro como con arsénico. La expresión de la proteína ArsH2 aumentó en presencia de arsenito o cianuro, lo que sugiere su papel en la protección del estrés oxidativo causado por ambos tóxicos. El arsenito también estimuló el metabolismo del tetrahidrofolato. Finalmente, se caracterizaron dos mecanismos de resistencia al As en la cepa CECT 5344, la extrusión de As(III) y su secuestro extracelular en la matriz extracelular (biofilm), cuya síntesis aumentó en presencia de arsenito, y la formación de compuestos organoarsenicales como el arseno-fosfoglicerato y el metil-As. Posteriormente, se aplicó el enfoque proteómico para revelar las bases moleculares de la destoxificación de cianuro y mercurio por P. pseudoalcaligenes CECT 5344. Esta bacteria alberga dos grupaciones de genes mer, cuya expresión se estimuló en presencia de cloruro de mercurio. La oxidasa alternativa insensible al cianuro CioAB y la nitrilasa NitC no se afectaron significativamente por el Hg, destacando así su importancia en la tolerancia y asimilación del cianuro en presencia de este metal pesado. La cepa CECT 5344 demostró una resistencia al mercurio significativamente mayor cuando la bacteria se cultivó con cianuro que con amonio, probablemente debido a la formación de complejos cianuro-mercurio. Además, la integración de datos proteómicos, bioinformáticos y transcripcionales sugirió un papel potencial de la proteína MerR2 como un regulador maestro en presencia de cianuro y mercurio. En general, el mecanismo de resistencia al Hg en la cepa CECT 5344 se basó en la actividad de la mercurio reductasa MerA y la extrusión de la forma volátil Hg0, con una acumulación residual dentro de las células, probablemente a través de la quelación a biomoléculas. Finalmente, también se aplicó un análisis proteómico cuantitativo por LC-MS/MS para caracterizar los cambios metabólicos en P. pseudoalcaligenes CECT 5344 durante un estilo de vida anaeróbica en presencia de hierro y amonio. El análisis proteómico reveló la inducción en condiciones anóxicas de proteínas asociadas al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, metabolismo de ácidos grasos, metabolismo de polihidroxialcanoatos, así como proteínas relacionadas con el hierro, entre otras. Se sugiera que el amonio, además de ser una fuente de N, participa en la reducción de Fe(III) a través del proceso de oxidación de amonio dependiente de Fe (Feammox), y la cadena respiratoria de transporte de electrones de esta bacteria estaría involucrada en la regeneración de Fe(III) a partir de Fe(II) para la reacción de Feammox acoplada a respiración de fumarato. Además, el exceso de fuente de carbono se derivó a la síntesis de polihidroxialcanoatos. Estos resultados son una visión preliminar sobre el metabolismo anaeróbico de la cepa CECT 5344, pero se requieren más estudios para corroborar esta hipótesis. En general, todos los resultados presentados en este trabajo destacan el gran y versátil potencial biotecnológico de la bacteria cianotrófica P. pseudoalcaligenes CECT 5344, y podrían ser útiles no solo para el diseño de estrategias de biorremediación de residuos industriales complejos cocontaminados con cianuro, arsénico y mercurio, sino también para el desarrollo de tecnologías anaeróbicas alternativas.