Vitrificación de esperma de caballo empleando crioprotectores no penetrantes

Abstract

La vitrificación de esperma es un método reciente de criopreservación, basado en la bajada de temperatura a alta velocidad introduciendo el esperma directamente en nitrógeno líquido, reduciendo la formación de grandes cristales de hielo, como ocurre en la congelación lenta tradicional. El objetivo de este estudio es valorar la vitrificación de esperma equino empleando crioprotectores no penetrantes como alternativa a la congelación lenta con glicerol. Para ello, se valoraron diferentes concentraciones de sacarosa y albúmina sérica bovina (BSA) en vitrificación de esperma equino (experimento 1). Posteriormente, se comparó la vitrificación con la congelación lenta tradicional de esperma de caballo (experimento 2). Para ello se recogieron un total de 33 eyaculados de 6 caballos mediante vagina artificial tipo Missouri. Los eyaculados libres de gel tras la recogida fueron analizadas para los parámetros volumen, concentración, movimiento total, progresivo e integridad de la membrana plasmática. Tras el proceso de vitrificación, se analizaron los parámetros movimiento total, progresivo, integridad de la membrana plasmática y de la membrana acrosomal (experimento 2). En el experimento 1 se evaluaron diferentes concentraciones de sacarosa: 0,02; 0,05; 0,1 moles/litro (molaridad, M) y de BSA: 1 %; 5 %; 10 % para vitrificación. En el experimento 2, se comparó la congelación lenta empleando glicerol (2,2 %) o sacarosa (0,02 M; 0,1 M) y 1 % BSA, con la vitrificación utilizando sacarosa (0,02 M) y de BSA (1%) por separado y en combinación. En el experimento1, los resultados demostraron que las concentraciones de 0,02M de sacarosa y 1% de BSA presentaban valores superiores significativamente para el movimiento espermático y la integridad de la membrana plasmática (P<0,05); además la combinación de 0,02 M de sacarosa y 1% de BSA obtuvo resultados mayores significativamente (P<0,05) para el movimiento total (55,67 ± 2,99 % vs. 35,41 ± 2,96 %) progresivo (38,32 ± 3,05 % vs. 14,42 ± 1,80 %) e integridad de la membrana plasmática (66,61 ± 2,69 % vs. 49,16 ± 2,60 %) que la congelación convencional. Por tanto concluimos que la vitrificación de esperma equino empleando crioprotectores no penetrantes es una alternativa a la congelación lenta convencional.

Vitrification of sperm is a new method of cryopreservation based on high speed freezing by direct exposure of sperm to liquid nitrogen, reducing the formation of big ice crystals. The aim of this study was to evaluate the effect of vitrification of equine sperm using sucrose and bovine serum albumin (BSA) as an alternative to slow freezing with glycerol. For this purpose, different concentrations of sucrose and BSA were compared for equine sperm’s vitrification (experiment 1). After that, vitrification of equine sperm was compared with traditional slow freezing (experiment 2). To achieve this objective 33 ejaculates were collected from 6 stallions using a Missouri-model artificial vagina. Gelfree semen samples were analyzed for the sperm parameters volume, concentration, motility and integrity of sperm membrane. After vitrification-warming process, motility, integrity of sperm membrane and acrosomal membrane (experiment 2) were evaluated. In experiment 1, different concentration of sucrose: 0.02; 0.05; 0.1 mole/litre (molarity, M) and BSA: 1 %; 5 %; 10 %, were used for vitrification. In experiment 2, we compared slow freezing using glycerol (2.2 %) or sucrose (0.02 M; 0.1 M) adding 1 % BSA, with vitrification using sucrose (0.02 M) and BSA (1 %) separately or combined. The results showed that 0.02 M sucrose and 1% BSA present the highest values for sperm motility and plasma membrane integrity (P<0.05); moreover, 0.02M sucrose and 1% BSA combined, obtained higher values (P<0.05) than conventional freezing, for the parameters total motility (55.67 ± 2.99 % vs. 35.41 ± 2.96 %), progressive (38.32 ± 3.05 % vs. 14.42 ± 1.80 %) and plasma membrane integrity (66.61 ± 2.69 % vs. 49.16 ± 2,60 %) with significant differences (P<0.05). We can therefore conclude that vitrification of equine sperm using non-permeable cryoprotectants could be an alternative to conventional slow freezing.