Integrated "omics" approaches to study non-orthodox seed germination: the case of holm oak (Quercus ilex. ballota [Desf.] Samp)
Aproximaciones -ómicas al estudio de la germinación de semillas de especies recalcitrantes: el caso de la encina (Quercus ilex subsp. ballota)
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Author
Romero-Rodríguez, M. Cristina
Director/es
Abril, NievesJorrín-Novo, Jesús V.
Publisher
Universidad de Córdoba, UCOPressDate
2015Subject
Encina (Quercus ilex L. subs. ballota [Desf.] Samp.Bosques de encina
Sostenibilidad
Semillas recalcitrantes
Germinación
Ténicas de Biología Molecular
Técnicas ómicas
Holm oak (Quercus ilex L. subsp. ballota [Desf.] Samp.)
Quercus ilex forest
Sustainability
Seedling growth
Germination
Biochemical approach
Omic approach
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La presente Tesis Doctoral está centrada en el estudio de la encina (Quercus ilex L. subsp.
ballota [Desf.] Samp.), una especie dominante en los sistemas silvopastorales mediterráneos. El
mantenimiento y la sostenibilidad de los bosques de encina se enfrenta actualmente con
problemas y retos mayormente relacionados con la conservación de semillas viables, ya que se
trata de una semilla recalcitrante, y con la alta tasa de mortalidad de los individuos adultos y
plantones luego de ser trasplantados a campo, resultado de las adversas condiciones
ambientales.
En el presente trabajo se llevó a cabo el estudio de la germinación de semillas de encina,
así como de plántulas en estadio temprano mediante una aproximación multidisciplinar que
combina las técnicas clásicas de biología molecular con las “ómicas”. Con este objetivo general
fueron propuestos los siguientes objetivos específicos
1. Realizar un análisis transcripcional de un grupo de genes candidatos implicados en
tolerancia a la de desecación, regulación de la señalización de ABA, metabolismo y
defensa contra el estrés oxidativo, a lo largo del proceso de germinación.
2. Identificar genes de expresión diferencial en semilla germinada y de plántulas muy
jóvenes de Q. ilex mediante el uso de hibridación sustractiva por supresión (SSH).
3. Identificar proteínas cuya abundancia se ve alterada durante la germinación y
desarrollo de plántulas en estadios tempranos, determinando los perfiles
proteómicos mediante aproximaciones basadas y libres de gel.
4. Identificar el phosphoproteoma y los cambios que ocurren durante la germinación
de semillas
Los resultados del análisis transcripcional del grupo de genes candidatos revelaron que
las semillas maduras de Q. ilex presentan algunas características fisiológicas intracelulares
propias de las semillas ortodoxas que incluyen (i) acumulación de azúcares (sacarosa) y
proteínas protectoras (DHN3) y (ii) acumulación de transcriptos implicados en la síntesis de
oligosacáridos osmorreguladores de rafinosa (GolS) y en la defensa contra el estrés oxidativo
(Sod1, Gst). Sin embargo, las semillas maduras de Q. ilex, como otras semillas recalcitrantes se
dispersan con un alto contenido de agua y mantienen el metabolismo parcialmente activo. Los
resultados de este análisis transcripcional fueron verificados y complementados con la
determinación de (i) niveles de fitohormonas (ABA, GA3, GA4, IAA, iP and iPR), (ii) acumulación
de azúcares (Sac, Glc, Fru) y (iii) determinación de proteínas mediante inmunodetección (DHN3,
GAPDH, RBCL) y actividad enzimática (SOD); estos resultados mostraron una buena correlación
con los transcriptos analizados.
El análisis de expresión diferencial de genes mediante SSH permitió identificar por
primera vez en Q. ilex un grupo de ESTs correspondiente a genes diferencialmente expresados
en semillas germinadas y plántulas en desarrollo temprano. En las semillas germinadas se
identificaron 31 genes sobre-expresados, entre los que se incluyen genes que codifican para
proteínas implicadas en la respuesta a estreses, transporte, defensa contra estrés oxidativo,
modificación de la pared celular, ciclo celular, metabolismo de proteínas y transducción. Por
otro lado, 39 transcriptos no redundantes se encontraron sobre-expresados en estadio
temprano de plántulas. Las proteínas codificadas por estos transcritos fueron agrupadas en
siete categorías funcionales que incluyen fotosíntesis, metabolismo secundario, transporte,
señalización, respuesta a diversos estreses, expresión génica y organización de componentes... This work is focused on holm oak (Quercus ilex L. subsp. ballota [Desf.] Samp.) a dominant
tree species in natural forest ecosystems over large areas of the Western Mediterranean Basin.
Q. ilex forest maintenance and sustainability are facing important problems and challenges
related to seed viability/conservation, and plant mortality in both adult trees and young oneyear-
old plants after field transplantation resulting from adverse environmental conditions
such as drought and the so-called decline syndrome.
In the present Doctoral Thesis, the germination and seedling growth of Q. ilex was studied
applying a multidisciplinary “omics” approach combined with classical biochemical approaches,
according to the actual trends in biosciences research. Within this general aim, specific
objectives pursued in this thesis were:
1. Determine the expression profile of a selected group of protein coding genes involved
in desiccation tolerance, regulation of ABA-signalling, metabolism and antioxidative
defence.
2. Identify differentially expressed genes between germinated seeds and seedlings of Q.
ilex by using a suppression subtractive hybridization (SSH).
3. Analyse changes in the proteomic profiles during germination and seedling growth
through gel based and gel free approaches.
4. Analyse the dynamic protein phosphorylation changes during seed germination and
seedling development.
The transcriptional analysis revealed that mature Q. ilex seeds show some of the
intracellular physiological characteristics of orthodox seed that included (i) accumulation of
non-reducing carbohydrates (sucrose) and protective proteins (DHN3) and (ii) accumulation of
transcripts involved in the synthesis of certain osmoregulator of raffinose series
oligosaccharides (GolS), the anti-oxidative defence (Sod1, Gst). But the holm oak mature acorns,
like other recalcitrant seeds, have the ability to maintain a partially active metabolism. The
transcriptional analysis results were verified and complemented with the determination of (i)
plant hormones levels (ABA; the gibberellins GA3 y GA4; the auxin IAA and the cytokinins iP
and iPR,) (ii) sugars accumulation (Suc, Glc, Fru) and (iii) proteins amounts determined by
immunoblotting (DHN3, GAPDH, RBCL) and/or enzymatic activity (SOD) and good correlation
was found whit transcript levels.
The analysis of differentially expressed genes by SSH allowed the identification for the
first time a large number of putative differentially expressed ESTs from the embryo axis in
germinated seeds and from shoot seedlings of Q. ilex during the postgermination and seedling
establishment. Thirty-one over-expressed genes were identified in germinated seeds at the
germination stage. Proteins encoded by these genes are representative of eight functional
categories: stress responses, transport, oxidation-reduction, cell wall modification, cell division
cycle, protein metabolism, cellular component organization and translation. On the other hand,
39 non-redundant transcripts over-represented in Q. ilex shoots seedlings were grouped in
seven functional categories: photosynthesis, secondary metabolism, transport, signalling, stress
response, gene expression and cellular component organization. These data constitute an
important genomics resource that should clearly benefit further germination and other
biological process research on Q. ilex...