Detección presintomática y no destructiva de enfermedades causadas por patógenos de suelo en maíz (Marchitez tardía) y en girasol (Jopo) mediante medidas térmicas y de fluorescencia multicolor

Abstract

Algunas enfermedades de cultivos originadas por patógenos de suelo se caracterizan por la tardía aparición de síntomas. Este es el caso de la Marchitez tardía del maíz (causada por el hongo Harpophora maydis) y del Jopo del girasol (causado por la planta parásita de raíz Orobanche cumana). Harpophora maydis se refirió por vez primera en la Península Ibérica en 2010 y durante los últimos años se ha convertido en una preocupación importante para los productores de maíz. Por el contrario, los ataques de O. cumana son frecuentes en los cultivos españoles de girasol desde los años 80. Esta parásita es actualmente el principal limitante biótico de la producción de aceite de girasol en el mundo. Tanto H. maydis como O. cumana infectan la planta hospedante durante las primeras semanas después de la siembra, aunque los síntomas no se hacen visibles hasta la floración del cultivo o poco después de que ésta tenga lugar. También ambas enfermedades se controlan mediante la incorporación de genes de resistencia en las variedades cultivadas. El progreso y el éxito de los programas de mejora para resistencia a enfermedades dependen enormemente de un acertado y eficaz diagnóstico de la reacción de la planta hospedante al patógeno. Por otro lado, en la actualidad son frecuentes las técnicas basadas en el uso de sensores lejanos y/o de proximidad utilizadas en agronomía. Como alternativa a la inspección visual y al análisis de ADN destructivo, y debido a su sensibilidad a desórdenes fisiológicos en las plantas asociados al ataque de patógenos, estas técnicas pueden ser eficaces herramientas de detección en fitopatología. En el caso de proximidad, la monitorización indirecta de las plantas se efectúa principalmente mediante termometría, termografía,medidas de fluorescencia y técnicas espectrales. En el Capítulo 1 de esta Tesis Doctoral se desarrolla el estado del arte de la Marchitez tardía del maíz y del Jopo del girasol. También se presenta información científica actualizada sobre las técnicas de sensores lejanos y/o de proximidad utilizadas más comúnmente en fitopatología. Los objetivos se presentan en el Capítulo 2. En primer lugar se estudió la distribución de H. maydis en la Península Ibérica, se caracterizó su patogenicidad y también se determinaron otras especies de hongos presentes en maíz afectado por marchitez. Además, se evaluó el potencial de la termometría infrarroja para detectar las infecciones por H. maydis. En segundo lugar se detectó la presencia de O. cumana en girasol durante las fases de crecimiento subterráneo de la planta parásita utilizando para ello imágenes de fluorescencia multicolor (FMC). También se consideraron las posibles alteraciones fisiológicas en el girasol como consecuencia de la infección por O. cumana. En el Capítulo 3 se estudió la distribución geográfica de H. maydis en las principales zonas de cultivo de maíz en España y el sur de Portugal, prospectando 59 campos entre 2009 y 2013. La identidad de 14 de entre todos los aislados de H. maydis obtenidos se confirmó mediante amplificación ITS y estos mismos aislados se caracterizaron por su agresividad mediante inoculación y crecimiento de maíz susceptible crecido en condiciones de umbráculo durante todo el ciclo del cultivo. Uno de los aislados del hongo fue muy agresivo, causando síntomas severos en las plantas y reducciones significativas de peso de sus raíces y partes aéreas. Los aislados moderadamente agresivos causaron valores de enfermedad significativos, pero no todos ellos se asociaron a reducciones de peso de las plantas. En 2012 y 2013 se monitorizó la infección por H. maydis en maceta al aire libre y mediante medidas de temperatura de cubierta y del índice de estrés hídrico del cultivo en plantas control y en plantas inoculadas con el aislado más agresivo. Ambos índices respondieron a la infección por el hongo en los dos años, pudiendo detectarse dicha infección hasta 17 días antes de que los síntomas fueran visibles. Este estudio ha revelado la amplia distribución de H. maydis, que se localiza en los valles de todos los ríos de la Península Ibérica excepto el del Ebro y pone de relieve la importancia de la resistencia genética para controlar este patógeno en el sur de Europa. Además, la detección térmica de la infección previa al desarrollo de síntomas podría resultar en aplicaciones útiles para el diagnóstico presintomático y no destructivo de la enfermedad. En el Capítulo 4 se determinaron las especies de hongos asociadas a H. maydis como agente causal de marchitez de maíz. Para ello, se muestrearon 19 campos con síntomas de marchitez en las principales zonas de cultivo de la Península Ibérica entre 2011 y 2012. En el 47% de ellos no se identificó H. maydis sino otras especies: Fusarium graminearum, F. verticillioides, F. equiseti, F. proliferatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani y Trichoderma harzianum. En los campos restantes, junto a H. maydis se identificaron otros hongos de suelo en porcentajes apreciables: F. verticillioides (19%), F. proliferatum (19%), F. equiseti (9%), F. oxysporum (9%) y Pythium oligandrum (9%). El crecimiento vascular de H. maydis y de otras especies de hongos en maíz se confirmó analizando plantas con marchitez procedentes de tres campos diferentes. Tanto H. maydis como F. graminearum, F. equiseti, F. proliferatum y T. harzianum se recuperaron de la inserción entre la raíz y tallo y a 10 cm de altura en el tallo de las plantas. El efecto de la infección por H. maydis sobre la producción de las plantas de maíz se cuantificó en macetas y condiciones seminaturales en 2011. El peso de las mazorcas de plantas inoculadas se redujo en un 54%. Estas plantas también tuvieron pesos de raíz y de parte aérea (tallo y hojas) significativamente menores que los de las plantas control. Estos resultados apuntan al gran impacto que puede tener la Marchitez tardía sobre la producción de maíz en campo. Además, y aunque la patogenicidad de los hongos de suelo identificados en maíz debería ser confirmada, los resultados de este trabajo sugieren que la Marchitez tardía del maíz puede tener una etiología compleja. En cuanto al Capítulo 5, en él se analizó por primera vez la fluorescencia emitida por la clorofila de girasol en las bandas espectrales con máximos en el rojo (F680) y en el rojo lejano (F740). Se incubaron plantas sanas de girasol en macetas y condiciones de invernadero y, entre la segunda y la quinta semana de crecimiento se compararon los patrones de emisión de fluorescencia de los cuatro primeros pares de hojas (PHs) tanto en la superficie de la hoja como entre PHs. Los PHs de plantas sanas de girasol presentaron similares patrones de fluorescencia, tanto en el rojo como en el rojo lejano, que variaron dependiendo del grado de desarrollo de la hoja. La utilidad de F680 y F740 como indicadores de la infección de girasol por O. cumana durante las fases de desarrollo subterráneo de la plana parásita se evaluó en condiciones experimentales similares. En plantas infectadas por O. cumana se detectaron aumentos tempranos de F680 y F740, así como reducciones del ratio F680/F7403. Por otro lado, la significación de las diferencias de fluorescencia emitida por plantas control y plantas inoculadas dependió del PH que se considerara en cada momento. Las medidas de contenido clorofílico y de contenido de clorofila total apoyaron los resultados de la FMC, aunque fueron menos sensibles en la discriminación de plantas control y plantas inoculadas. Al final del experimento se confirmó la infección del girasol por la presencia de nódulos en las raíces de las plantas. Este trabajo revela el potencial de la fluorescencia en las regiones del rojo y el rojo-lejano para detectar de forma temprana la infección de girasol por O. cumana, lo que podría ser especialmente interesante para llevar a cabo un fenotipado temprano de material de programas de mejora. Más aún, y hasta donde hemos podido conocer, este es el primer trabajo donde se analiza el efecto de una planta parásita sobre su hospedante utilizando imágenes de fluorescencia en el rojo y en el rojo lejano. En el Capítulo 6 se analizó la emisión de fluorescencia azul y verde (FAV) en hojas de plántulas sanas de girasol. Además, se aplicaron tanto la FAV como la técnica de termografía para detectar la infección del girasol por O. cumana durante el desarrollo subterráneo de la planta parásita. En ambos experimentos se incubaron las plantas de girasol en macetas en invernadero y las medidas se tomaron tras el traslado temporal a cámara de condiciones controladas. En el primer experimento se observó que la FAV emitida por hojas de girasol sano aumentaba a lo largo de su desarrollo. En el caso de girasol parasitado, las hojas presentaban emisiones de FAV menores, y esta diferencia respecto a las hojas de las plantas control fue consistente a lo largo de todo su desarrollo. Al final del experimento se obtuvieron menores concentraciones de pigmentos, lo que sugiere que en las hojas de girasol ocurre un descenso de metabolitos secundarios tras la infección por O. cumana. Por otro lado, a lo largo de todo el experimento se detectaron mayores temperaturas de hoja en girasol inoculado con O. cumana en comparación con la temperatura de hojas de plantas control. Esto podría indicar que el ataque de la planta parásita induce un cierre estomático y una reducción de la transpiración del girasol. En el trabajo de nuevo se ha demostrado que es posible efectuar una monitorización no destructiva de la infección de girasol por O. cumana, en este caso utilizando FAV y termografía, y que dicha monitorización podría aplicarse al fenotipado rápido de girasol. Además, ambas técnicas se han revelado como útiles aproximaciones para estudiar los procesos mediante los cuales O. cumana altera la fisiología de su hospedante (metabolismo secundario y fotosíntesis). Por último, la discusión general de todos los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral y las conclusiones derivadas se presentan en los Capítulos 7 y 8 respectivamente.

Some crop diseases caused by soilborne pathogens are characterised by very late symptoms appearance. This is the case of Late wilt of maize (caused by the fungus Harpophora maydis) and that of Broomrape of sunflower (caused by the root parasitic plant Orobanche cumana). Harpophora maydis was first reported in the Iberian Peninsula in 2010, and during the last years it has become a major concern to maize growers. On the contrary, attacks of O. cumana are frequent in sunflower growing areas of Spain since the 1980’s. Currently, the parasite is the first biotic constraint to sunflower oil production worldwide. Both H. maydis and O. cumana infect the host plant during the first weeks after sowing but symptoms are not observed until flowering or shortly after it. Also, they are controlled through the incorporation of genes of resistance into the crop varieties. The advancement and success of breeding programmes is highly dependent on an accurate and fast screening of the reaction of the host plant to the pathogen. On the other hand, techniques based on the use of remote and/or proximal sensors are frequently used with agronomical purposes. As an alternative to visual inspection and to destructive analyses of DNA, and because its sensitivity to physiological disorders in plants associated with pathogen attack, these techniques can constitute efficient detection tools in phytopathology. In the case of near distance, indirect monitoring of plants is majorly conducted by means of thermometry, thermography, fluorescence measurements and spectral techniques. In Chapter 1 of this Ph.D. Thesis, the state of the art of maize late wilt and sunflower broomrape is presented, as well as updated scientific information about the remote and proximal sensing techniques that are most commonly used in plant pathology. The objectives are presented in Chapter 2. First, the distribution of H. maydis in the Iberian Peninsula and its pathogenic characterization were addressed as well as the identification of other fungal species found in symptomatic maize. Also, the utility of infrared thermometry on the detection of maize infections by H. maydis was assessed. Second, the presence of O. cumana in sunflower was analysed during underground development stages by means of multicolour fluorescence (MCF). Possible physiological disorders in sunflower as a consequence of O. cumana infection were also considered. In Chapter 3 the geographical distribution of H. maydis in the main maize growing areas in the South of Portugal and Spain was determined by prospecting 59 fields from 2009 to 2013. Fourteen out of all the isolates of H. maydis were molecularly confirmed by ITS amplification, and their aggressiveness was analysed by inoculation and growth of susceptible maize under shadehouse conditions for the whole growing season. One of the isolates was highly aggressive, causing severe symptoms as well as significant weight reductions of both aboveground parts and roots of the inoculated plants. Moderately aggressive isolates caused significantly high symptoms severity, but not all of them were related to reductions in plant weight. In 2012 and 2013, the infection by H. maydis was monitored outdoors by means of measurements of canopy temperature and crop water stress index of potted control plants and plants inoculated with the most aggressive isolate. Both indices responded to the presence of fungal infection in both years, this infection being detected up to 17 days before symptoms in the plants were visible. This study shows the distribution of H. maydis in all the river valleys of the Iberian Peninsula, except that of the Ebro River, and highlights the importance of genetic resistance for controlling the pathogen in southern Europe. In addition, the thermal detection of the infection prior to symptoms development was possible, what might be further applied to the non-destructive pre-symptomatic diagnosis of Late wilt of maize. The species of fungi that are associated to H. maydis as the causal agent of maize wilt were identified in Chapter 4. Surveys were conducted in 2011 and 2012 in 19 fields where symptomatic plants were collected. The fields were located in the main maize growing areas of the Iberian Peninsula. In 47% of them the fungus infecting diseased plants was not H. maydis but Fusarium graminearum, F. verticillioides, F. equiseti, F. proliferatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani and/or Trichoderma harzianum. In the remaining fields H. maydis was identified together with other soilborne fungi that were also frequently isolated from diseased plants: F. verticillioides (19%), F. proliferatum (19%), F. equiseti (9%), F. oxysporum (9%) and Pythium oligandrum (9%). The vascular growth of H. maydis and other fungi into the host was confirmed by means of tissue analyses of diseased plants collected at three different locations. Harpophora maydis, as well as F. graminearum, F. equiseti, F. proliferatum and T. harzianum were recovered from the root-stem insertion, and from stem tissues up to 10 cm high. The effect of the infection by H. maydis on maize yield was assessed in inoculated potted plants that were grown in shadehouse in 2011. Cob production was reduced in 54% upon fungal infection. In addition, significantly low weights of roots and aboveground parts (stems and leaves) were obtained. These results point to the great economic impact that Late wilt can have on the yield of maize under field conditions. Likewise, this work suggests that it can be a disease of a complex etiology. Further work should address the pathogenicity of fungal species other than H. maydis on maize, so that the role they may play on disease incidence and on symptoms severity can be determined. Concerning Chapter 5, the fluorescence emitted by chlorophyll (Chl) of sunflower leaves in the spectral bands with peaks near red (F680) and far-red (F740) was analysed for the first time. Healthy sunflowers were grown in pots under greenhouse conditions. Fluorescence emission patterns across the leaf surface and throughout the plant were compared for the first four leaf pairs (LPs) and between the second and fifth weeks of growth. Similar fluorescence patterns, with a delay of three or four days between them, were obtained for LPs of healthy sunflower, showing that red and far-red fluorescence varied with the developmental stage of the leaves. The use of F680 and F740 as indicators of the infection of sunflower by O. cumana during underground development stages of the parasite was also evaluated under similar experimental conditions. Early increases in F680 and F740 as well as decreases in F680/F740 were detected upon infection, significant differences between inoculated and control plants being dependent on the LP that was considered at any time. Measurements of Chl contents and final total Chl content supported the results of MCFI, although they were less sensitive in differentiating healthy from inoculated plants. The infection of sunflowers was confirmed by the presence of broomrape nodules in the roots at the end of the experiment. This work revealed the potential of MCFI in the red and far-red regions for early detecting O. cumana in sunflower, what might be particularly interesting for early phenotyping in sunflower breeding programmes. Furthermore, and to the best of our knowledge, this is the first time that the effect of a parasitic plant in its host is analysed by means of MCFI. In Chapter 6 we analysed the blue-green fluorescence (BGF) emission of leaves of healthy sunflower plantlets, and we implemented BGF and thermal imaging in the detection of the infection by O. cumana during underground parasite development. In both experiments sunflowers were grown in pots and under greenhouse conditions and measurements were made after temporary movement to chamber of controlled conditions. Increases in BGF emission were observed in leaf pairs of healthy sunflowers during their development. Besides, lower BGF emission was consistently detected in parasitised plants throughout leaf expansion, and low pigment concentration was obtained at final time, supporting the interpretation of a decrease in secondary metabolites upon parasite infection. Also, parasite-induced stomatal closure and transpiration reduction were suggested by warmer leaves of inoculated sunflowers throughout the experiment. Techniques of BGF and thermal imaging allowed the non-destructive monitoring of sunflower broomrape, and they could be implemented for fast screening of sunflower genotypes. Additionally, these techniques were shown as valuable approaches to assess the processes by which O. cumana alters physiology (secondary metabolism and photosynthesis) of sunflower. Finally, the general discussion of all the results from the work included in this Ph.D. Thesis and the conclusions drawn from them are presented in Chapters 7 and 8 respectively.