Estudio del hígado y líquido peritoneal en fases tempranas de ovejas infectadas experimentalmente con Fasciola hepatica
Study of the liver and peritoneal fluid of sheep in early stages of experimental infection with Fasciola hepatica
Autor
Ruiz-Campillo, María Teresa
Director/es
Pérez Arévalo, JoséMolina Hernández, Verónica
Zafra Leva, Rafael
Editor
Universidad de Córdoba, UCOPressFecha
2018Materia
OvejasEnfermedades parasitarias
Fasciola hepatica
Fasciolosis
Respuesta inmunitaria
Anatomía patológica veterinaria
METS:
Mostrar el registro METSPREMIS:
Mostrar el registro PREMISMetadatos
Mostrar el registro completo del ítemResumen
La fasciolosis causada por Fasciola hepatica es una enfermedad
parasitaria de gran repercusión sanitaria y económica en rumiantes,
principalmente en zonas de clima templado. Este parásito ha desarrollado
mecanismos capaces de modular o suprimir la respuesta inmunitaria del
hospedador, haciéndola inefectiva y permitiendo la instauración crónica
del parásito. La investigación de los mecanismos de inmunomodulación de
F. hepatica resulta crucial para poder diseñar una vacuna eficaz que pueda
solventar el problema de la instauración de resistencias frente a los
antihelmínticos tradicionalmente utilizados en el control de esta
enfermedad.
Se han llevado a cabo numerosos estudios para determinar los
mecanismos de respuesta inmunitaria y acción del parásito en las fases
crónicas de la enfermedad. Sin embargo, los estudios en las fases
tempranas, cuando el parásito atraviesa el intestino y migra hacia el hígado
a través del compartimento peritoneal son escasos y casi todos en el
modelo murino. El principal objetivo de la presente Tesis Doctoral es
estudiar la respuesta inmunitaria en el compartimento peritoneal y en el
hígado en las fases tempranas de infecciones experimentales con F.
hepatica en la oveja.
Para la consecución de este objetivo, se llevaron a cabo dos
experimentos (experimento 1 y experimento 2). En cada experimento se
utilizaron 25 ovejas de 8 meses de edad de raza Merina las cuales fueron
divididas en 5 grupos (n=5), cuatro de los cinco grupos se infectaron
oralmente con una dosis de 150 metacercarias de F. hepatica. Estos grupos
fueron eutanasiados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi). El quinto
grupo se utilizó como grupo control no infectado y se sacrificó al final del experimento. Durante la necropsia, se realizaron lavados peritoneales de
los animales inmediatamente después de los sacrificios para la recogida del
líquido peritoneal y, posteriormente, se tomaron muestras de hígado.
En los experimentos 1 y 2, el líquido peritoneal se utilizó para
realizar el contaje absoluto y diferencial de los leucocitos peritoneales. Los
resultados revelaron un reclutamiento activo de leucocitos hacia la cavidad
peritoneal de la oveja en los animales infectados a partir de los 9 dpi,
principalmente representado por eosinófilos. Los frotis de células
peritoneales se sometieron a la técnica de inmunocitoquímica para
determinar la expresión de los marcadores celulares: CD68, CD14, CD206,
iNOS, CD83 y MHC-II, los cuales están presentes en macrófagos y en
células dendríticas. El aumento significativo en la expresión de CD206 y
escasa variación en la expresión de iNOS en los macrófagos peritoneales
en ambos experimentos sugieren que existe una polarización hacia un
fenotipo de activación alternativa o M2 desde el día uno tras la infección.
El aumento significativo en la expresión del marcador CD14 desde el 3 dpi
en comparación con el grupo no infectado en ambos experimentos, podría
estar relacionado con fenómenos tanto de activación fagocítica en los
macrófagos como de fibrosis. En el experimento 1, se observó un
aumento en la expresión del marcador de células dendríticas maduras
CD83 y del marcador de células presentadoras de antígeno MHC-II desde
el 1 dpi. Sin embargo, este hecho no ocurrió de una manera tan obvia en el
experimento 2, debido a la elevada variabilidad entre animales.
El estudio de la expresión de citoquinas del líquido peritoneal
mediante qRT-PCR de ovejas infectadas (18 dpi) y no infectadas del
experimento 1, determinó la presencia elevada de las citoquinas IL-10, IL-
12, IL-13, IL-23 y TGF-β en ovejas a los 18 dpi, aunque sin diferencias significativas en comparación con los resultados del grupo control no
infectado, indicando que la respuesta inmunitaria en este compartimento
no ha sido todavía estimulada hacia una de tipo Th2, asociada con la
enfermedad crónica.
Con el fin de evaluar la presencia de posibles biomarcadores en la
infección temprana con F. hepatica, se realizó un estudio de proteómica
con muestras del líquido peritoneal y de inmunohistoquímica con muestras
de hígado de los animales infectados y sacrificados a los 18 dpi y de los
animales control no infectados del experimento 1. En el estudio
proteómico del líquido peritoneal se identificaron proteínas relacionadas
con la infección, incluyéndose diversas proteínas estructurales derivadas
de la matriz extracelular hepática, relacionadas con el tejido conectivo y el
epitelio, y proteínas relacionadas con el sistema inmunitario. Cabe destacar
el marcado aumento de la proteína periostina en el líquido peritoneal y en
el citoplasma de los hepatocitos localizados alrededor de los focos
necróticos de animales infectados a los 18 dpi. Se ha relacionado que la
periostina podría ser un biomarcador de respuestas inflamatorias de tipo
Th2 en las que están involucradas los eosinófilos. El origen de la presencia
de esta proteína en el líquido peritoneal podría ser el propio tejido hepático
dañado por el parásito o los eosinófilos peritoneales, estando esta proteína
involucrada en procesos de fibrosis.
La molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) también fue
identificada mediante proteómica, estando presente de manera abundante
en el líquido peritoneal de ovejas infectadas (18 dpi) y, además, se observó
una marcada expresión en el tejido hepático. Esta proteína se asocia con
procesos crónicos y podría estar involucrada, junto con la periostina, en la
mediación del reclutamiento leucocitario que tiene lugar en la cavidad peritoneal, estando también relacionadas con desórdenes inflamatorios
caracterizados por una eosinofilia marcada. Fascioliasis is a parasitic disease caused by Fasciola hepatica with
important sanitary and economic repercussion on ruminants in temperate
zones. This parasite has developed mechanisms that are able to suppress the
host immune response, thus allowing the establishment of the parasite and
resulting in chronic disease. Research based on the understanding of F.
hepatica immunomodulatory mechanisms is crucial for the designing of an
effective vaccine to solve the issue of the emerging resistance to the
traditionally use of antihelmintic drugs.
Numerous studies have been carried out to determine the modulatory
effects of the parasite in the chronic phase of the disease. However, studies
in the early stages of the infection are scarce and mostly focused on murine
models. The principal aim of this Thesis is to study the immune response to
F. hepatica infection in the early stages of infection within the peritoneal
compartment and liver in sheep.
Two experiments were carried out, namely experiment 1 and
experiment 2. In each experiment, twenty-five 8-month-old Merino-breed
sheep were used for each experiment and were allocated into five groups (n
= 5). Four of the five groups were orally infected with a dose of 150
metacercariae of F. hepatica and euthanized at 1, 3, 9 and 18 days postinfection
(dpi). The fifth additional group was used as uninfected control.
During the necropsy, peritoneal lavages were performed and liver samples
were taken.
In experiments 1 and 2, absolute and differential number of
peritoneal leucocytes were obtained. The absolute number of leucocytes
increased from 9 dpi onwards in both experiments compared to the
uninfected control group, being these leucocytes mainly composed by eosinophils. These results suggest that there is an active recruitment of
leucocytes into the peritoneal cavity at these eary stages of infection. The
peritoneal cells were fixed in smears and subjected to the
immunocytochemistry technique to assess the following cellular markers:
CD68, CD14, CD206, iNOS, CD83 and MHC-II. Macrophages and
dendritic cells were considered for the immunocytochemical assessment.
Peritoneal macrophages showed a marked increase in CD206 expression
since one dpi onwards in both experiments respect to the uninfected control
group, while mild change in iNOS expression was found along the infection
in both experiments. These results suggest that a polarization towards an
alternative phenotype (M2) was taking place in peritoneal macrophages
from the first dpi onwards. The expression of CD14 increased since 3 dpi
onwards in macrophages from both experiments comparing with the
uninfected control group, which may be due to an increase in the
macrophage activity related to tissue repair and phagocytosis. In
experiment 1, there was an increase in the expression of the mature
dendritic cell marker CD83 and the antigen-presenting cell marker MHC-II
since one dpi onwards compared to the uninfected control group.
Nevertheless, this fact was not found in experiment 2, perhaps due to the
high individual variability found between sheep of the same group.
In experiment 1, a study of the peritoneal fluid of infected (18 dpi)
and uninfected sheep was carried out using the qRT-PCR technique.
Cytokines IL-10, IL-12, IL-13, IL-23 and TGF-β gene expression showed a
tendency to be enhanced with respect to the uninfected control group.
Nevertheless, no statistical differences were found, suggesting that the
immune response has not yet been skewed towards a Th2 type, associated
with chronic disease. With the aim of evaluating the presence of possible biomarkers in
the early infection with F. hepatica, a proteomic study using peritoneal fluid
together with an immunohistochemical study with liver samples from
infected (18 dpi) and non-infected animals from experiment 1 was
conducted. Proteomic analysis of the peritoneal fluid identified infectionrelated
proteins, including several structural proteins derived form the liver
extracellular matrix, connective tissue and epithelium, and immune systemrelated
proteins. A marked increase in the amount of periostin protein in the
peritoneal fluid and in the cytoplasm of the hepatocytes located around the
necrotic foci of infected animals at 18 dpi was observed. It has been pointed
out that periosin could be a biomarker for Th2 type immune reponses in
which eosinophils are involved.
The vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) was also
identified by proteomics, with marked increase at 18 dpi respect to the
uninfected control group and strong expression within the liver tissue. This
protein has been associated with chronic processes and could be involved,
along with periostin, in the mediation of leucocyte recruitment that takes
place in the peritoneal cavity of infected animals, being also present in
inflammatory disorders characterized by marked eosinophilia.