Identification of novel clinical and molecular factors for the diagnosis and aggressiveness of prostate cancer

Abstract

Prostate cancer (PCa) is the most common solid neoplasm in men in developed countries. Unfortunately, the extraordinary heterogeneity and complexity of PCa, together with its phenotypic/clinical variability, strongly influenced by the endocrinemetabolic environment, makes it difficult to find common clinical-molecular elements that would facilitate global and effective diagnostic/prognostic/therapeutic strategies. Based on this information, the hypothesis of this Doctoral Thesis is that the metabolic state and some of the factors associated to it could be associated to the presence and aggressiveness of CaP, and that a more profound study of some tools usually used in the clinical practice of PCa (Risk Calculators-RCs), as well as of some families of proteins poorly studied to date in PCa could be very useful for the identification of novel methods and/or biomarkers for the diagnosis, prognosis and/or treatment of PCa. First, we studied and compared the usefulness of different risk predictor tools based on RCs combining different clinical variables, focusing on studying the effectiveness and the variability of their results within two consecutive PSA measurements. Specifically, two RCs were used: the “Prostate Cancer Prevention Trial risk calculator 2.0 (PCPT-RC 2.0)” and the “European Randomized study of Screening for Prostate Cancer risk calculator (ERSPC-RC)”, selecting 510 patients for the analisis wherein both RCs showed good external validation. The comparison between the two RCs did not reveal any significant differences. The addition of free PSA improved the accuracy of the PCPT- RC (AUC= 0.65 vs. 0.73). According to the precision results, the decision curve analysis was also similar between the two RCs, which showed a net benefit from an early risk threshold, meaning that their implementation would improve the selection of patients for prostate biopsy. However, the ERSPC-CR had better stability for intra-individual variations of PSA. Secondly, we evaluated the association of Metabolic Syndrome (MetS), inflammatory parameters [specifically the C-Reactive Protein (CRP)] and testosterone levels with the biopsy result in a prospective cohort of 524 patients scheduled for a prostate biopsy with suspected PCa. Not only the presence of MetS, but also a greater number of MetS criteria and a higher level of circulating CRP, but not testosterone, were associated with an increased risk of significant PCa (Sig PCa; Gleason ≥7). Interestingly, when we analyzed each MetS criterion independently, we found that only two criteria, an increased waist circumference and blood pressure, were significantly associated with an increased risk of Sig PCa. In the analysis of novel biomarkers, a study of a panel of urinary peptide markers by CE-MS (“Capillary electrophoresis–mass spectrometry”) was carried out using a cohort of 823 patients. The analysis in the training cohort identified 19 peptide biomarkers, from which sequences for 17 could be obtained. The panel of 19 peptides selected in the training cohort (n=543 patients) was validated on an independent validation set of 280 patients with an AUC value of 0.81, ranged from 0.76 to 0.86. In addition, comparison with the ERSPC-RC showed that this panel clearly outperformed the nomogram for Sig PCa diagnoses [model with 19 biomarkers vs. ERSPC-RC; AUC = 0.82 vs 0.69, respectively (p= 0.02)], also in a decision curve analysis. In relation to the study of isolated biomarkers, Ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) is a key enzyme that regulates the activity of the ghrelin system and has been shown to be overexpressed in PCa tissues (at mRNA and protein levels) and its plasma levels elevated in PCa patients, but its potential role as a non-invasive biomarker of patients at-risk of PCa has not been studied previously. We evaluated GOAT as a diagnostic marker of PCa in a case-control study of 312 patients divided into three groups: patients with PCa, patients at risk of PCa but with a negative result in the biopsy and healthy controls. Plasma levels of GOAT were significantly higher in patients with PCa compared to healthy patients and patients at risk of PCa but with negative biopsy result. In addition, these levels were even higher in patients diagnosed with Sig PCa. Moreover, the subpopulation of patients with a PSA between 3-20 ng/ml was selected for direct comparison with PSA, revealing that the accuracy of GOAT for the diagnosis of Sig PCa was significantly better than that of PSA in this population (where PSA accuracy was dramatically low). The analysis of the association of GOAT levels with aggressive features showed a correlation between Gleason grade and GOAT levels and also with an increased risk of being diagnosed with metastasis. Finally, we studied transcription factors containing homeodomain [Engrailed (EN) genes 1 and 2], which have been previously evaluated in different tumors, including PCa. Specifically, we intended to evaluate the usefulness of EN2 as a noninvasive marker and study, for the first time, its oncogenic role. Firstly, EN2 was overexpressed in the two available PCa tissue cohorts compared to control tissues, in different tumor cell lines compared to the normal type RWPE-1 cells, as well as on available external cohorts of patients analyzed "in silico". Consistently, urine EN2 levels showed higher levels in patients with PCa, being the percentage of urine EN2 detection in patients with PCa of 75% vs. the 45% found in the controls (p= 0.05). EN2 protein was then found to be secreted by PCa cell lines, while its levels were below the limit of detection in normal RWPE-1 cells. In line with this, we found that EN2 increases the tumor potential in prostate cells, i.e. a greater capacity for proliferation, migration or PSA secretion, by modulating certain key signalling pathways. Interestingly, our results also show an increase in the phosphorylation rate of androgen receptor (AR), AR splicing variants and AKT after EN2 treatment in LNCaP and/or 22Rv1. Therefore, the results presented in this Doctoral Thesis constitute novel and valuable information that supports several ideas: 1) The appropriate use of free tools to estimate the risk of PCa based on common clinical variables would improve the clinical practice; 2) The MetS and parameters related to inflammation (CRP levels) are associated with the diagnosis of clinically Sig PCa and with its aggressiveness; 3) The analysis of a combination of peptide markers can improve the ability to diagnose clinically Sig PCa; 4) GOAT enzyme can be a useful marker to complement PSA information, when PSA loses more capacity, and to improve the diagnosis of Sig PCa and its aggressiveness; 5) Engrailed 2 could be used as a non-invasive biomarker for the diagnosis of PCa, and could be a useful tool for the development of new drugs for this pathology.

El cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia sólida más frecuente en varones en países desarrollados. Desafortunadamente, la extraordinaria heterogeneidad y complejidad del CaP, unida a su variabilidad fenotípica/clínica, fuertemente influenciada por el ambiente endocrino-metabólico, hace difícil encontrar elementos clínico-moleculares comunes que faciliten estrategias diagnósticas, pronósticas y/o terapéuticas globales y efectivas. Partiendo de esta base, la hipótesis de la presente Tesis Doctoral es que el estado metabólico y alguno de los factores asociados al mismo podrían estar relacionados con la presencia y agresividad del CaP, y que el estudio más profundo de algunas herramientas utilizadas habitualmente en la práctica clínica del CaP (calculadoras de riesgo o “Risk Calculators”) y de algunas familias de proteínas poco estudiadas hasta la fecha en CaP podrían ser de gran utilidad para identificar nuevos métodos y/o biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y/o tratamiento del CaP. En primer lugar, estudiamos y comparamos la utilidad de herramientas predictoras de riesgo que se basan en calculadoras de riesgo (CRs) combinando diferentes variables clínicas, centrándonos en estudiar su efectividad y la variabilidad de su resultado en dos mediciones consecutivas del PSA. Específicamente, se usaron dos CRs: “Prostate Cancer Prevention Trial risk calculator 2.0 (PCPT-RC 2.0)” y “European Randomized study of Screening for Prostate Cancer risk calculator (ERSPC-RC)” seleccionando 510 pacientes para el análisis, observando una buena validación externa con ambas CRs. La comparación entre ambas CRs no reveló diferencias significativas. La adición de PSA libre mejoró la precisión del PCPT-CR [Área bajo la curva (AUC)= 0,65 vs. 0,73]. De acuerdo con los resultados de precisión, el análisis de la curva de decisión también fue similar entre las dos CRs, que mostraron un beneficio neto desde un umbral de riesgo temprano, lo que significa que su implementación mejoraría la selección de pacientes para la biopsia de próstata, si bien, el ERSPC-CR tuvo mejor estabilidad para las variaciones intraindividuales de PSA. En segundo lugar, se evaluó la asociación de Síndrome Metabólico (MetS), parámetros inflamatorios [(específicamente la proteína c-reactiva (PCR)] y niveles de testosterona con el resultado de la biopsia en una cohorte prospectiva de 524 pacientes con sospecha de Ca programados para una biopsia de próstata. Los resultados revelaron que no sólo la presencia de MetS, sino también un mayor número de criterios de MetS y un mayor nivel de PCR circulante, pero no de testosterona, se asociaron con un mayor riesgo de CaP significativo (CaP Sig; Gleason ≥7). Curiosamente, cuando analizamos cada criterio de MetS de forma independiente, encontramos que sólo dos criterios, una mayor circunferencia de la cintura y la presión arterial, se asociaron significativamente con un mayor riesgo de CaP Sig. Para los análisis de nuevos biomarcadores, se realizó un estudio de un panel de marcadores peptídicos urinarios mediante CE-MS (“Capillary electrophoresis–mass spectrometry”) utilizando una cohorte de 823 pacientes. El análisis en la cohorte de entrenamiento permitió la identificación de 19 biomarcadores peptídicos, de los cuales se pudieron obtener secuencias para 17. El panel de 19 péptidos seleccionados en la cohorte de entrenamiento (n= 543 pacientes) fue validado en un conjunto de validación independiente de 280 pacientes con un valor de AUC de 0,81 [Intervalo de confianza: 0,76-0,86]. Además, la comparación con el ERSPC-CR mostró que este panel claramente superó al nomograma para los diagnósticos de CaP Sig [modelo de 19 biomarcadores vs. ERSPC-CR; AUC= 0,82 vs 0,69, respectivamente (p= 0,02)], también en el análisis de la curva de decisión. En relación con el estudio de biomarcadores aislados, la ghrelina Oacyltransferasa (GOAT) es una enzima clave que regula la actividad del sistema de la ghrelina, la cual se ha demostrado que está sobreexpresada en tejidos de la CaP (a nivel de ARNm y proteína) y sus niveles plasmáticos elevados en pacientes con CaP; sin embargo, su supuesta función como biomarcador no invasivo del CaP en pacientes de riesgo no ha sido estudiada previamente. Por tanto, se intentó evaluar el uso de la GOAT como biomarcador diagnóstico no-invasivo de CaP en un estudio caso-control de 312 pacientes divididos en tres grupos: Pacientes con CaP, pacientes con riesgo de CaP pero resultado negativo en la biopsia y controles sanos. Los niveles plasmáticos de GOAT fueron significativamente más altos en pacientes con CaP en comparación con pacientes sanos y pacientes en riesgo de CaP pero con resultado negativo en la biopsia. Además, estos niveles fueron aún más altos en pacientes diagnosticados con CaP Sig. De hecho, la selección de la subpoblación de pacientes con un PSA entre 3-20 ng/ml, reveló que la precisión de la GOAT para el diagnóstico de CaP Sig fue mejor que la del PSA en esta población (donde la precisión del PSA fue dramáticamente baja). El análisis de la asociación de los niveles de GOAT con características agresivas mostró una correlación entre los niveles de GOAT con el grado Gleason y una asociación con un mayor riesgo de ser diagnosticado con metástasis. Por último, estudiamos más profundamente factores de transcripción que contienen homeodominio [genes Engrailed (EN) 1 y 2], que previamente habían sido evaluados en diferentes tumores, incluyendo CaP. Concretamente, se pretendió evaluar la utilidad de la EN2 como marcador no invasivo y estudiar, por primera vez, su papel oncogénico en CaP. En primer lugar, la EN2 se sobreexpresó en las dos cohortes analizadas de tejidos de CaP en comparación con los tejidos control y en las líneas celulares tumorales en comparación con las células RWPE-1 de tipo normal, así como en diversas cohortes de muestras externas disponibles (análisis “in silico”). De manera consistente, los niveles de EN2 en orina mostraron niveles más altos en pacientes con CaP, siendo el porcentaje de detección de EN2 en orina en pacientes con tumor del 75% vs. el 45% encontrado en los controles (p= 0,05). A continuación, se encontró que la proteína EN2 era secretada por líneas celulares de CaP, mientras que sus niveles se encontraban por debajo del límite de detección en las células RWPE-1 normales. Finalmente, se demostró que la EN2 aumenta el potencial tumorigénico en las células prostáticas, es decir, una mayor capacidad de proliferación, migración o secreción de PSA, mediante la modulación de ciertas vías de señalización claves en CaP. Curiosamente, nuestros resultados también muestran un aumento en la tasa de fosforilación del receptor de andrógenos (AR), sus variantes de splicing y de la ruta AKT después del tratamiento EN2 en LNCaP y/o 22Rv1. Por todo ello, los resultados presentados en esta Tesis Doctoral constituyen una información novedosa y valiosa que respalda varias ideas: 1) Existen herramientas gratuitas útiles para estimar el riesgo de CaP basado en variables clínicas habituales cuyo uso mejoraría la práctica clínica; 2) El síndrome metabólico y parámetros relacionados con la inflamación (PCR) se encuentran asociados al diagnóstico de CaP clínicamente significativo y con su agresividad; 3) El análisis de una combinación de marcadores peptídicos puede mejorar la capacidad de diagnóstico de CaP clínicamente significativo; 4) la enzima GOAT puede ser un marcador útil para complementar la información del PSA, cuando este pierde más capacidad, y mejorar el diagnóstico de CaP significativo y su agresividad; 5) Engrailed 2 podría utilizarse como biomarcador no invasivo para el diagnóstico del CaP, así como servir como una herramienta útil para el desarrollo de nuevos fármacos para esta patología.