Mechanisms of longevity extension and healthy aging by over-expression of cytochrome b5 reductase 3

Abstract

Introduction. Aging is a natural time-dependent process characterized by the accumulation of damage in cellular structures that compromises cellular and tissue function leading ultimately to the death of the organism. Furthermore, aging is the most significant risk factor for chronic diseases including cancer, cardiovascular disease (CVDs) and neurodegeneration. Nine candidates have been proposed as the main features of aging. These candidates which have been regarded as "The Hallmarks of Aging" are: telomere attrition, genomic instability, epigenetic alterations, loss of proteostasis, mitochondrial dysfunction, deregulated nutrient sensing, cellular senescence, stem cell exhaustion, and altered intercellular communication. Given the great complexity of the changes that participate in the establishment of the aging phenotype, numerous theories have been proposed to explain its aetiology, but neither of them appears to be capable of fully explaining the origin of this process, and they often contradict each other. Among them, the Free Radical Theory of Aging proposes that oxidative stress and redox imbalance are factors directly related with aging. The general idea of this theory is to consider reactive oxygen species (ROS) and other reactive species, that are continuously generated in the organism, as the main cause of aging. Therefore, cellular aging is associated with chronic oxidative stress. ROS are products of normal cellular metabolism in mitochondrial respiration and can be also produced in defensive responses of cells against infectious agents, upon exposure to xenobiotics, cytokines, redox stress, and in a several of intracellular signaling pathways. Mitochondria are both the main source and a major target of ROS. Mitochondria are one of the most important organelles in aerobic organisms, as the sites where aerobic respiration takes place to produce the energy that is necessary to sustain most cellular processes. Mitochondria also participate in additional cellular processes of great relevance, including β-oxidation of fatty acids, calcium signaling, and apoptosis. However, ROS and free radicals are generated as by-products of mitochondrial metabolism that attack nucleic acids, proteins, and membrane phospholipids. Among phospholipids, those containing polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are more susceptible to oxidation by free radicals, leading to lipid peroxidation that causes a loss of membrane fluidity and impairs many cell functions. Additionally, with age, mitochondrial enzymes, ATP production, and respiratory capacity decline and, at the same time, ROS and mitochondrial mutations increase, being these changes accompanied by alterations in morphology and abundance of these organelles. Mutations in mtDNA result in a loss of mitochondrial function and turnover. This leads to the autophagic digestion of defective mitochondria which, if not accompanied by efficient mitochondrial biogenesis, may lead to the consequent decrease in the synthesis of ATP and bioenergetic dysfunction. Mitochondria are generated by growth and division of pre-existing organelles. In addition, they are highly dynamic structures that undergo continuous changes in size, shape, number, and distribution, which is highly controlled by a balance between fusion and fission. Their dynamics is determined by mitochondrial turnover, biogenesis, and a balance between the frequency of fusion and fission events. These events are critical for the normal function of cells, allowing the replacement of old or damaged mitochondria which are continuously removed from the cell. All these mechanisms allow the maintenance and distribution of mtDNA, the quality control of the organelle, and the regulation of apoptosis. Imbalanced mitochondria dynamics contributes to the loss of mitochondrial homeostasis, leading to alterations in mitochondrial function, metabolism, and signaling. Progressive mitocondrial dysfunction is considered a hallmark of aging, and it has been involved in a wide range of pathological conditions whose incidence increases with aging, as neurodegenerative diseases, diabetes, CVDs, muscle atrophy and cancer, and it is also related with several processes of embryonic development. Mitochondria are eliminated when they are damaged or dysfunctional through a process regulated called mitophagy. Nutritional and genetic interventions are among the strategies currently followed by researchers to delay or even reverse the deleterious consequences of aging. Caloric restriction (CR) without malnutrition is the most effective nongenetic intervention that delays aging and increases lifespan in numerous organisms. Beneficial effects of CR on longevity are mainly due to an improvement in mitochondrial function. Furthermore, there is an important metabolic adaptation to CR, causing substantial changes in numerous signaling pathways that regulate growth, metabolism, repair of damage, oxidative stress, autophagy and inflammatory processes. Among these changes, CR increases the amount of monounsaturated fatty acids (MUFAs) in membranes while decreasing PUFAs without any observed changes in saturated fatty acids (SFA), which is in accordance with the Theory of Membranes in Aging that proposes that lifespan is inversely related to the level of unsaturation, particularly the level of n-3 PUFA, in membrane phospholipids. Moreover, CR modulates key molecules involved in the regulation of autophagy and increases NAD+ levels activating enzymatic activity of the sirtuins (SIRTs). Homeostasis of NAD+ is important for the maintenance of many functions and protection against aging and age-related diseases. NAD+ is a metabolic regulator and its efficacy has been reported in metabolic diseases such as insulin resistance, fatty liver or hypertension. The overexpression of enzymes capable of generating NAD+ from the oxidation of NADH, as NADH-cytochrome b5 reductase-3 (CYB5R3), is another strategy that is currently under evaluation. CYB5R3 is a flavoprotein that participates in the elongation and desaturation of fatty acids, which seems to be an excellent candidate as a novel effector for the regulation of metabolism, mainly at mitochondrial level. CYB5R3 plays an important role in the regulation of metabolic pathways associated with healthspan and aging through mechanisms that appear to be related with protection against oxidative stress, production of cellular NAD+ and alterations in fatty acids composition. Although CYB5R3 shows a constitutive basal expression in many tissues, its expression can be also induced in response to environmental stress and nutrient deprivation. Constitutive expression of the Cyb5r3 gene is controlled by SP1 transcription factor, which can be further upregulated through pathways involving forkhead box O3 (FOXO3a) and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NFE2L2) transcription factors. Mice overexpressing this protein showed increased longevity and displayed greater protection against diseases associated with aging. At the metabolic level, CYB5R3 overexpression increases insulin sensitivity, decreases inflammation and oxidative stress, and protects mice against cancer induction. Therefore, this enzyme plays a fundamental role in the regulation of lipid metabolism that allows to increase lifespan, suggesting that strategies aimed at incrementing CYB5R3 expression and/or activity may constitute viable interventions to confer protection against metabolic pathologies and to improve healthspan. Dietary fats are essential components to generate energy. Fatty acids (FAs) can be categorized as saturated (SFAs), monounsaturated (MUFAs), or polyunsaturated (PUFAs) and most of them can be synthesized by the organisms excepting the socalled essential fatty acids that must be ingested through the diet. In addition, FAs are an important source of energy due to their ability to be efficiently stored as triglycerides (TGs). Several studies have reported the relationship between dietary fat and the risk of metabolic and CVDs, among other disorders. Diets rich in MUFAs and PUFAs have cardioprotective effects, while the relationship between SFA and the risk of coronary heart disease is still controversial. Fatty acids can undergo autoxidation reactions generating lipid peroxides that affect the properties of biological membranes. Additionally, the toxic products derived from peroxidation can damage proteins, DNA, and other biomolecules. Since lipids are prone to oxidation, which exerts negative effects in health, the use of antioxidants in foods has become extensive to prevent lipid oxidation. The liver and heart are closely related in health and in disease. Deregulated hepatic lipid metabolism and many metabolic diseases, such as diabetes and obesity, are ultimately detrimental to cardiac function. The liver is the main organ in the regulation of energy metabolism. It performs three essential functions: the metabolic processing of proteins, carbohydrates and lipids after their absorption in the intestine, the detoxification of toxic agents and substances, and the storage of energy in form of glycogen. In spite of some changes occurring during aging (see below), the liver ages fairly well. Although in normal conditions hepatocyte turnover rate is low, the liver shows a relatively high rate of regeneration. That is why this organ has been widely used as a model to study the effects of diets, CR and other anti-aging interventions. Aging-related changes in liver include a reduction of weight and volume, a decline in the rate of hepatic regeneration, increased size of hepatocytes, polyploid nuclei, decreased area of smooth endoplasmic reticulum, decreased clearance of free radicals, and a decrease in the number and function of mitochondria, resulting in a decline in the ATP production. Aging is also associated with redistribution of fat in the body characterized by increased fat deposition in non-adipose tissues, including liver. All these structural and functional alterations could contribute to the development of liver disease with age. The heart is the main organ of the circulatory system and one of the first organs to be formed during the embryonic development. The heart is a complex organ containing different cell types that contribute to the structural, biochemical, mechanical, and electrical properties of the organ. Among the cell types, cardiomyocytes, responsible for the contractile function of the myocardium, are well differentiated cells without regeneration capacity. The most drastic changes in heart function occurring with age are: left ventricular hypertrophy, alterations in the diastolic function, aortic valve calcification, arrhythmia and heart failure. These alterations are, at least in part, due to a decrease in the number of cardiomyocytes, as well to hypertrophy and fibrosis due to an increased collagen and alterations in the extracellular matrix. As postmitotic cells, cardiomyocytes are highly susceptible to age-related mitochondrial damage and ROS production which results in an overall enhancement in the rate of cardiomyocyte death with age. The progressive decline of cardiomyocyte mitochondrial function is considered the major mechanism underlying heart aging, in addition to the accumulation of cholesterol and fatty acids in tissues which lead to the production of inflammatory cytokines as well as ROS that further contribute to CVDs prevalence and mortality. Starting hypothesis and objectives. Previous studies developed in our group were focused on NADH-cytochrome b5 reductase-3 (Cyb5r3) as a new pro-longevity gene. Mice overexpressing CYB5R3 contain higher levels of polyunsaturated fatty acids in hepatic membranes, which resembles, at least partially, the effects of the consumption of a diet containing fish oil or the overexpression of the Fat-1 gene of C. elegans. Unsaturated fatty acids show high susceptibility to peroxidation. However, CYB5R3 transgenic mice exhibited a significant reduction in lipid peroxidation. The specific changes in FA composition that take place in mice overexpressing CYB5R3 may be the result of a metabolic reprogramming, and could be indicative of an improvement in mitochondrial function, leading to a lower generation of ROS and the prevention of the oxidative damage accumulation, which partially mimics the effects observed in animals subjected to CR. These mice showed increased insulin sensitivity and improved regulation of glucose homeostasis, less inflammation and decreased oxidative damage, and were protected against induced cancer. However, mice over- expressing CYB5R3 fed a standard diet ad libitum were fatter than wild-type controls, and preferentially use carbohydrate to meet their energy needs. This differs from studies with CR as antiaging intervention that showed an improvement in healthspan and lifespan due to the enhancement of β-oxidation as a preferential source of energy. Thus, CYB5R3 overexpression could contribute to extend lifespan in mice by mechanisms that may be independent of those described for CR. Since CYB5R3 increase has been reported in long-term CR intervention, it has been hypothesized that the beneficial effects of CR could be mediated, at least partially, by a such increase of CYB5R3. However, it has not yet been studied how the CYB5R3 overexpression affects mitochondrial processes that are relevant to determine the aging pattern, and how the alterations in fatty acid composition and CR can interact with the changes elicited by CYB5R3 overexpression in transgenic mice. The working hypothesis of this PhD is that mitochondrial efficiency is optimized in CYB5R3 transgenic mice, which leads to an improvement in energy production and better preservation of mitochondria during aging. For this reason, our main objective has been to study several mitochondrial function markers in liver and heart tissues of CYB5R3-overexpressing mice submitted to nutritional interventions (CR and alterations in fat composition of the diet) and aging. To this end, we have pursued the following 5 specific aims: 1. To study the physiological effects of CYB5R3 overexpression, dietary fats, CR and aging on body composition and biochemical profile. 2. To characterize the CYB5R3 overexpression in liver and heart in the three proposed interventions. 3. To determine the combined effect of CYB5R3 overexpression and CR on key markers of mitochondrial function. 4. To determine dietary conditions that maximize mitochondrial preservation in mice overexpressing CYB5R3. 5. To determine the effects of aging on the mitochondria parameters studied in the previously indicated aims in CYB5R3 overexpressing mice. The results of this PhD can help identify healthy lifestyles and nutritional patterns that can modulate healthy aging and extend longevity, as well as to identify new mitochondrial targets that allow the preservation of mitochondrial physiology and aid in the prevention of metabolic diseases associated with age.

Introducción. El envejecimiento se define como el declive funcional dependiente del tiempo que se caracteriza por la acumulación de daños en las estructuras celulares, comprometiendo la función celular y tisular dando lugar, en último término, a la muerte del organismo. El envejecimiento es el principal factor de riesgo de las enfermedades crónicas incluyendo cáncer, enfermedades cardiovasculares (CVDs) y neurodegenerativas. Se han propuesto nueve causas principales por las que se produce el envejecimiento: las denominadas “marcas distintivas del envejecimiento”, que son las siguientes: acortamiento telomérico, inestabilidad genómica, modificaciones epigenéticas, pérdida de la proteostasis, disfunción mitocondrial, desregulación de la detección del estado nutricional, senescencia celular, alteración de la comunicación intercelular y perdida de células madre. Para tratar de explicar los cambios celulares que dan lugar el fenotipo del envejecimiento se han propuesto numerosas teorías, pero, debido a la complejidad de este proceso, ninguna de ellas puede explicar completamente el origen del envejecimiento. De estas teorías, la llamada Teoría de los Radicales Libres propone que el estrés oxidativo y el desajuste en el estado redox del organismo dan lugar al envejecimiento. Esta teoría considera que las especies reactivas de oxígeno (ROS) y otras especies reactivas (que están continuamente generándose en el organismo) son la principal causa del envejecimiento. Por lo tanto, el envejecimiento celular estaría provocado por un estrés oxidativo crónico. Las ROS son productos del metabolismo celular producidos por la respiración mitocondrial, respuesta defensiva de las células frente a agentes infecciosos, exposición a xenobióticos, respuesta a citoquinas y estrés redox. Además, actúan como moléculas de señalización celular. Las mitocondrias son la mayor fuente de ROS y las principales afectadas por el daño oxidativo que estas moléculas pueden llegar a causar. Además, son uno de los orgánulos más importantes en los organismos aeróbicos, que se encargan de la respiración celular y producen la energía necesaria para las funciones vitales de la célula. Las mitocondrias también participan en otros procesos celulares de gran importancia como la β-oxidación de ácidos grasos, homeostasis de calcio y apoptosis. Sin embargo, las ROS y los radicales libres son productos del metabolismo mitocondrial que, debido a su alta reactividad, interaccionan con los ácidos nucleicos, proteínas y fosfolípidos de membranas, dañando sus estructuras. Los fosfolípidos de membrana que contienen ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) son los más susceptibles de ser oxidados por los radicales libres, dando lugar a la peroxidación lipídica, que altera las características de las membranas biológicas y afecta considerablemente a la función celular. Por otro lado, con el envejecimiento, las enzimas mitocondriales, la producción de ATP y la capacidad respiratoria de la célula disminuyen, a la vez que aumenta la producción de ROS. Los daños producidos en las mitocondrias dan lugar a mutaciones y alteraciones en la morfología y abundancia de estos orgánulos. Las mutaciones en el DNA mitocondrial (mtDNA) dan lugar a una pérdida de la función mitocondrial y a una desregulación de su recambio en la célula. El recambio mitocondrial se produce mediante la eliminación de mitocondrias dañadas por el proceso de autofagia, y la síntesis de nuevas mitocondrias a través de la biogénesis mitocondrial. Alteraciones en alguno de esos procesos dan lugar a una disminución de la síntesis de ATP y disfunción bioenergética. La biogénesis mitocondrial se produce por el crecimiento y división de mitocondrias preexistentes. Además, estos orgánulos son altamente dinámicos y están constantemente cambiando de forma, tamaño, número y distribución en la célula. Esta dinámica está controlada por un balance entre los procesos fusión y fisión mitocondrial, siendo estos eventos críticos para el correcto funcionamiento de las células que, a su vez, permiten el reemplazo de las mitocondrias viejas o dañadas. Todos esos mecanismos, además, participan en la distribución del DNA mitocondrial, en el mantenimiento del orgánulo en condiciones óptimas y en la regulación de la apoptosis. Un desajuste en la dinámica mitocondrial da lugar a la perdida de la homeostasis del orgánulo, provocando alteraciones en su funcionamiento, metabolismo y señalización. La disfunción mitocondrial progresiva está considerada una marca distintiva del envejecimiento e involucra una gran variedad de condiciones patológicas que aumentan con el envejecimiento como son las enfermedades neurodegenerativas, diabetes, CVDs, atrofia muscular y cáncer. También están implicadas en numerosos procesos del desarrollo embrionario. La eliminación mitocondrial por autofagia es un proceso altamente regulado llamado mitofagia. Con el fin de retrasar o revertir los efectos deletéreos del envejecimiento, numerosas intervenciones nutricionales y genéticas están siendo estudiadas. Entre ellas, la restricción calórica (CR) sin malnutrición es la intervención no genética más efectiva que retrasa el envejecimiento e incrementa la vida máxima en numerosos organismos. Los efectos beneficiosos de la CR sobre la longevidad se deben en gran parte a una mejora en la función mitocondrial. Además, la CR produce adaptaciones metabólicas muy importantes dando lugar a cambios en numerosas rutas de señalización que participan en el crecimiento, metabolismo, mecanismos de reparación de daños, estrés oxidativo, autofagia y procesos inflamatorios. Entre esos cambios, la CR aumenta el contenido de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), disminuye el contenido de PUFA y no provoca cambios en la cantidad de ácidos grasos saturados (SFA) en las membranas biológicas, lo que apoya la Teoría de las Membranas en el envejecimiento que establece que la longevidad máxima esta inversamente relacionada con el nivel de insaturación de las membranas biológicas, particularmente con los niveles de PUFA n-3. Por otro lado, la CR modula moléculas clave que participan en la regulación de la autofagia e incrementa los niveles de NAD+ resultando en la activación de enzimas como las sirtuinas. La homeostasis de NAD+ es importante para el mantenimiento de muchas funciones y protección frente al envejecimiento y de las enfermedades relacionadas con éste. El NAD+ es un regulador metabólico y su eficacia ha sido probada en enfermedades metabólicas como la resistencia a insulina, hígado graso o hipertensión. La sobreexpresión de enzimas capaces de generar NAD+, como la NADH citocromo b5 reductasa 3 (CYB5R3), es una estrategia que está siendo estudiada actualmente. La CYB5R3 es una flavoproteína que participa en la elongación y desaturación de ácidos grasos, lo que la hace una excelente candidata para la regulación del metabolismo, principalmente a nivel mitocondrial. La CYB5R3 tiene un rol fundamental en la regulación de rutas metabólicas asociadas con la prolongación de la vida saludable y el envejecimiento a través de mecanismos que parecen estar relacionados con la protección frente a estrés oxidativo, la producción de NAD+ celular y las alteraciones en la composición de ácidos grasos. A pesar de que esta proteína tiene una expresión basal constitutiva en muchos tejidos, puede ser también inducida en respuesta a estrés ambiental y deprivación de nutrientes. La expresión constitutiva del gen Cyb5r3 está controlada por el factor de transcripción SP1, siendo además regulada por los factores de transcripción FOXO3a y NFE2L2. Los ratones que sobrexpresan CYB5R3 muestran una mayor longevidad y una mayor protección frente enfermedades asociadas con el envejecimiento. A nivel metabólico, la sobreexpresión de esta enzima aumenta la sensibilidad a insulina, disminuye la inflamación y el estrés oxidativo y protege a los ratones frente a la inducción de cáncer. Además, esta enzima tiene un papel fundamental en la regulación del metabolismo lipídico, lo que permite aumentar la esperanza de vida, sugiriendo que aquellas estrategias centradas en aumentar su expresión y/o actividad pueden constituir intervenciones viables que confieran protección frente a patologías metabólicas y prolonguen la vida saludable. Los ácidos grasos son componentes de la dieta esenciales para generar energía. Los ácidos grasos pueden ser categorizados como saturados (SFA), monoinsaturados (MUFA) y poliinsaturados (PUFA) y la mayoría de ellos pueden ser sintetizados por el organismo, a excepción de los llamados ácidos grasos esenciales, que solamente pueden ser obtenidos a través de la ingesta. Además, los ácidos grasos son fuentes importantes de energía que pueden ser almacenados en forma de triglicéridos. Numerosos estudios han informado de la relación de los ácidos grasos de la dieta con el riesgo de enfermedades metabólicas y cardiovasculares, así como con otros trastornos. Las dietas ricas en MUFA y PUFA tienen efectos cardioprotectores, mientras que la relación entre SFA y el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares sigue en debate. Los ácidos grasos pueden dar lugar a reacciones de autooxidación provocando peroxidación lipídica, lo que afecta a las propiedades de las membranas biológicas. Además, los productos tóxicos derivados de la peroxidación lipídica pueden dañar proteínas, DNA y otras biomoléculas. Debido a que los lípidos son propensos a la oxidación y causar efectos negativos en la salud, se ha extendido el uso de antioxidantes en los alimentos para prevenir su oxidación. El hígado y el corazón son dos órganos estrechamente relacionados en la salud y enfermedad. La desregulación del metabolismo lipídico hepático y muchas enfermedades metabólicas como la diabetes y la obesidad son, en última instancia, perjudiciales para la función cardíaca. El hígado es el principal órgano que regula el metabolismo energético desempeñando tres funciones fundamentales: el procesamiento metabólico de proteínas, carbohidratos y lípidos tras su absorción en el intestino, la detoxificación de agentes tóxicos y fármacos, y el almacenamiento de energía en forma de glucógeno. El hígado envejece relativamente bien a pesar de algunos cambios que ocurren con el envejecimiento. En condiciones normales el hígado tiene una tasa de regeneración bastante alta, a pesar de que el recambio de sus hepatocitos es relativamente bajo. Es por ello que el hígado ha sido muy utilizado por los investigadores como modelo de estudio del efecto de las dietas, la CR y otras intervenciones antienvejecimiento. Los cambios relacionados con la edad que experimenta el hígado incluyen una reducción del peso y volumen del órgano, el aumento del tamaño de los hepatocitos, la aparición de núcleos poliploides, una disminución del área del retículo endoplásmico liso, una menor capacidad de eliminación de ROS y la disminución en el número y función de las mitocondrias, procesos que tienen como resultado un declive de la producción de ATP. El envejecimiento ha sido asociado con la redistribución de la grasa del cuerpo, caracterizado por un incremento en la deposición de grasa visceral, incluido el hígado. Todos esos cambios estructurales y funcionales pueden contribuir a desarrollar enfermedades hepáticas con la edad. El corazón es el órgano principal del sistema circulatorio y, debido a su importancia, es uno de los órganos que se forman en primer lugar durante el desarrollo embrionario. El corazón es un órgano complejo formado por diferentes tipos celulares que dan lugar a sus distintivas propiedades estructurales, bioquímicas, mecánicas y eléctricas. Los cardiomiocitos son las células responsables de la función contráctil del miocardio y son células altamente diferenciadas sin capacidad de regeneración. Los cambios más drásticos que se producen en la función cardiaca con el envejecimiento son: hipertrofia del ventrículo izquierdo, alteraciones de la función diastólica, calcificación de la válvula aórtica, arritmia y fallo cardiaco. Esas alteraciones son, en parte, debido a una disminución en el número de cardiomiocitos, así como la hipertrofia y fibrosis provocadas por un incremento en el colágeno y por las alteraciones de la matriz extracelular. Como células postmitóticas, los cardiomiocitos son altamente susceptibles a los daños mitocondriales relacionados con el envejecimiento y producción de ROS, lo que potencia su muerte con la edad. El declive progresivo de la función mitocondrial de los cardiomiocitos es considerado la señal más clara de envejecimiento en el corazón. Por otra parte, la acumulación de colesterol y ácidos grasos en los tejidos da lugar a la producción de citoquinas inflamatorias, así como a ROS, que contribuyen a la prevalencia y mortalidad de las CVDs. Hipótesis inicial y objetivos. Estudios previos desarrollados en nuestro grupo se han centrado en como un nuevo gen con efectos pro-longevidad. Los ratones que sobre-expresan CYB5R3 presentan un número elevado de PUFA en las membranas hepáticas, efecto que se asemeja (al menos parcialmente) a los producidos por el consumo de una dieta rica en aceite de pescado o por sobreexpresión de la desaturasa Fat-1 de C.elegans. Los ácidos grasos insaturados son altamente susceptibles a la peroxidación. Sin embargo, los ratones transgénicos que sobre-expresan CYB5R3 muestran una reducción significativa en la peroxidación lipídica. Los cambios específicos en la composición de ácidos grasos que tiene lugar con la sobreexpresión de esta proteína pueden ser el resultado de un reajuste en el metabolismo, lo que además podría indicar una mejora en la función mitocondrial dando lugar a menos generación de ROS y la prevención de acumulación de daño oxidativo, efectos que mimetizan parcialmente a los observados en los animales sometidos a CR. Esos ratones transgénicos muestran una mayor sensibilidad a la insulina y una mejora en la homeostasis de la glucosa, menor inflamación, disminución del daño por estrés oxidativo y mayor prevención frente a la inducción de cáncer. Sin embargo, los ratones que sobre-expresan CYB5R3 alimentados ad libitum con una dieta estándar presentaron mayor peso corporal que sus controles y preferentemente obtenían energía del metabolismo de los carbohidratos. Por el contrario, los estudios centrados en la CR como intervención antienvejecimiento han mostrado una mejora en la prolongación de la vida saludable y de la longevidad máxima debido a una mayor utilización de la β-oxidación de ácidos grasos como fuente principal de energía, lo que difiere de los mecanismos por los que actúa la sobreexpresión de CYB5R3. Por lo tanto, la sobreexpresión de CYB5R3 puede contribuir a prolongar la vida máxima en ratones por mecanismos independientes de los descritos por la CR. Por otra parte, se ha informado que una intervención de CR a largo plazo induce la sobreexpresión de CYB5R3, por lo que se piensa que el efecto beneficioso de la CR podría estar mediado, al menos en parte, por el incremento de CYB5R3. Sin embargo, no ha sido estudiado aún cómo la sobreexpresión de CYB5R3 afecta a los procesos mitocondriales que son relevantes para determinar la pauta de envejecimiento. Tampoco se ha descrito cómo las alteraciones en la composición de ácidos grasos y la CR podrían interaccionar con los cambios provocados por la sobreexpresión de CYB5R3 en ratones transgénicos. La hipótesis de trabajo de esta Tesis Doctoral es que la eficiencia mitocondrial está optimizada en ratones transgénicos que sobre-expresan CYB5R3, lo que da lugar a una mejora en la producción de energía y una mayor preservación de la mitocondria durante el envejecimiento. Por esto mismo, nuestro principal objetivo ha sido estudiar marcadores mitocondriales en hígado y corazón de ratones que sobreexpresan esta proteína, sometidos a diferentes intervenciones nutricionales (CR y alteraciones en la composición de ácidos grasos de la dieta), así como estudiar cómo se ven afectados estos factores por el envejecimiento. Para lograr este fin, hemos planteado 5 objetivos específicos: 1. Estudiar el efecto fisiológico de la sobreexpresión de CYB5R3, los ácidos grasos de la dieta, la CR y el envejecimiento sobre el peso corporal y el perfil bioquímico. 2. Caracterizar la sobreexpresión de CYB5R3 en hígado y corazón en las tres intervenciones propuestas. 3. Determinar los efectos combinados de la sobrexpresión de CYB5R3 y de la CR sobre marcadores clave de la función mitocondrial. 4. Determinar los patrones nutricionales que maximizan la preservación mitocondrial en ratones que sobreexpresan CYB5R3. 5. Determinar los efectos del envejecimiento sobre los parámetros mitocondriales estudiados en los objetivos previamente citados, en ratones sobre-expresantes de CYB5R3. Los resultados de esta Tesis Doctoral podrían ayudar a identificar estilos de vida saludables y patrones nutricionales que pueden modular el envejecimiento saludable y la extensión de la vida máxima. También servirán para identificar nuevas dianas que permitan la preservación de la fisiología mitocondrial con el objetivo de prevenir enfermedades metabólicas asociadas con el envejecimiento.