Nuevas técnicas electroquímicas para la determinación de la capacidad antioxidante en extractos alimentarios basadas en el método CUPRAC

Abstract

Estado de la cuestión. La mayoría de las reacciones que ocurren en la naturaleza son producidas por reacciones redox, en las cuales hay una transferencia de electrones entre especies químicas. Las reacciones de óxido-reducción son biológicamente relevantes para el metabolismo de todos los seres vivos, ya que éstos obtienen la mayor parte de su energía a partir de ellas, como son por ejemplo la fotosíntesis y el metabolismo aeróbico. Aunque el oxígeno es imprescindible para la vida, también puede ser el propulsor de diversas enfermedades debido a una producción incontrolada de radicales libres, entre los que se encuentran las especies reactivas de oxígeno (ROS: “Reactive Oxygen Species”). Las ROS son moléculas muy pequeñas altamente reactivas debido a sus electrones desapareados. Estas especies se forman de manera natural como subproducto del metabolismo del oxígeno y tienen un importante papel en la señalización celular, pero en épocas de estrés ambiental sus niveles pueden aumentar mucho, rompiendo el equilibrio y provocando daños significativos a las estructuras celulares, provocando una situación conocida como estrés oxidativo. El daño causado por el estrés oxidativo depende principalmente de la reactividad del radical libre y la disponibilidad de un sustrato cercano al lugar donde se lleva a cabo la formación de los radicales libres. Al producirse un aumento de radicales libres, se origina un estado oxidante que repercute sobre el sistema redox de la propia célula, causando graves daños en gran número de biomoléculas como lípidos, proteínas, glúcidos y ácidos nucleicos impidiendo su correcto funcionamiento. Por otro lado, aunque los radicales libres sean conocidos por sus efectos dañinos sobre el organismo, también son necesarios para el correcto funcionamiento celular, ya que las células necesitan estar rodeadas de un ambiente oxidativo para poder llevar a cabo sus funciones biológicas. Para ello, los organismos poseen mecanismos de defensa antioxidantes para prevenir, retrasar o detener la producción de radicales libres. Sin embargo, cuando hay un aumento considerable de la velocidad de formación de ROS con respecto a las condiciones normales, se origina como consecuencia una disminución de los mecanismos propios de defensa, derivando en una situación de desequilibrio entre las especies oxidantes y las antioxidantes. El desequilibrio redox originado se puede relacionar con más de un centenar de enfermedades: procesos patológicos como el Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Crohn, ciertos tipos de cáncer o diabetes mellitus; patologías cardiovasculares como ateroesclerosis; procesos reumáticos, patologías gastroentéricas y afecciones broncopulmonares. También los procesos fisiológicos como el envejecimiento, el daño causado por el ejercicio físico agotador, etc. El balance entre los agentes oxidantes y antioxidantes determina el estado redox, manteniéndose una “homeostasis redox” o estado de equilibrio de las condiciones de oxidación-reducción finales. Aunque es difícil evitar la formación de radicales libres, sí es posible minimizar los efectos negativos que afectan al organismo. Para ello, es necesario un aumento en los niveles de antioxidantes para lograr un equilibrio en el sistema celular. Los antioxidantes son sustancias que presentes en concentraciones bajas, en comparación con el sustrato oxidable, retrasan significativamente o evitan la oxidación de éste. Dependiendo de la interacción de los antioxidantes con los sustratos oxidantes, los antioxidantes pueden ser de tipo I, II, III, según se lleve a cabo: el impedimento de formación de radicales libres, la interrupción de la propagación de radicales libres o desplazamiento de las ROS, y la reparación del daño causado por los radicales libres o eliminación de las moléculas que se han estropeado, respectivamente. En los últimos años ha habido un gran interés por la investigación de antioxidantes de origen natural frente a los de origen sintético, siendo también de gran interés el desarrollo de productos cosméticos enfocados principalmente en el tratamiento del envejecimiento cutáneo. El consumo de antioxidantes naturales frente a los sintéticos está mucho más aceptado y demandado comercialmente por la población, siendo su consumo un refuerzo de las defensas naturales propias del organismo. El gran interés del uso de antioxidantes naturales se debe principalmente al gran número y variedad de productos fitoquímicos con elevado poder antioxidante, los cuales se encuentran en la mayoría de los alimentos, llegando así a suprimir el consumo crónico de antioxidantes sintéticos presentes en gran variedad de bebidas y alimentos. El consumo de antioxidantes naturales ofrece beneficios frente a las evidencias toxicológicas a largo plazo de los antioxidantes sintéticos, relacionadas directamente con la formación de radicales libres. La seguridad que presentan los productos fitoquímicos hace que la población tenga más confianza en ellos. La determinación de la actividad antioxidante de compuestos puros resulta imprescindible para conocer la protección frente a la oxidación o el deterioro del alimento que lo alberga en su composición. Además de que estos antioxidantes se encuentran en diferentes proporciones, no se encuentra uno solo en cada alimento, sino que lo más normal es encontrar mezclas de diferentes compuestos antioxidantes, y cada uno con una capacidad diferente, lo que dificulta la tarea. Hay una necesidad de adquirir métodos unificados estandarizados que permitan servir de protocolo para una correcta aplicación del ensayo, comparar los resultados entre alimentos o productos comerciales, su aplicación útil como herramienta en el control de calidad, así como proveer de estándares para la regulación y las declaraciones de efectos en la salud. De manera adicional, debe exigirse el cumplimiento de otros requisitos como instrumentación fácilmente accesible, alta sensibilidad, alta reproducibilidad, simplicidad, rapidez y bajo coste, entre otros. En los últimos años, los métodos espectrofotométricos han adquirido cierta repercusión en el análisis in vitro de la capacidad antioxidante de muestras biológicas y extractos vegetales, pero presentan limitaciones debidas a la coloración en las muestras o del producto de reacción o a la precipitación del producto de reacción, provocando un aumento de la turbidez de la muestra que da lugar a errores por defecto o exceso. Además, para los compuestos inestables, un tiempo de incubación relativamente alto impide la determinación de la capacidad antioxidante. Para CUPRAC, el pH de trabajo es de 5.5 y se necesitan grandes cantidades de disolvente no acuoso (etanol) para disolver a la neocuproína, por lo que su principal limitación se debe a las condiciones no fisiológicas utilizadas. La sencillez y el bajo coste asociado a diversas técnicas electroquímicas ha demostrado que son una alternativa válida para evaluar el poder antioxidante pudiéndose realizar las medidas a pH fisiológico. En general, los compuestos antioxidantes actúan como agentes reductores y tienden a ser fácilmente oxidados sobre la superficie de un electrodo. En base a este hecho, se establece una relación intrínseca entre el comportamiento electroquímico del compuesto antioxidante y su consiguiente actividad antioxidante. Objetivo. El objetivo principal de la memoria es desarrollar estrategias electroquímicas para la determinación de la capacidad antioxidante (CAO), basadas en las reacciones de oxidación-reducción del cobre, que permitan sustituir el método CUPRAC, evitando la presencia de neocuproína y, por tanto, utilizando condiciones de trabajo más cercanas a las fisiológicas. Estas metodologías se aplican al estudio de los extractos en medio acuoso y etanólico de los frutos de plantas del género Capsicum y cáscaras de cítricos, muy utilizados en alimentación y cosmética.