Identificación de biomarcadores de disfunción del tejido adiposo en condiciones de resistencia a insulina

Abstract

El constante incremento de la prevalencia de la obesidad a nivel mundial, que está alcanzando dimensiones epidémicas, constituye un grave problema de salud pública, debido al desarrollo de comorbilidades graves asociadas a esta patología, como la resistencia a insulina (IR), diabetes tipo 2 (T2D), enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), dislipemias, enfermedades cardiovasculares, asma, hipertensión arterial, hipercolesterolemia, accidentes cerebrovasculares, artritis, enfermedades neurodegenerativas e incluso ciertos tipos de cáncer. Durante el desarrollo de la obesidad, ocurre un desequilibrio entre el gasto energético y la ingesta calórica producido por múltiples factores complejos y variables entre los que encuentran el sexo, la edad, el ambiente socio-cultural, una alimentación descontrolada –asociada, o no, a procesos emocionales–, y la actividad física. Independientemente del/los factor/es que provocan el desarrollo de obesidad, la disfunción del tejido adiposo subyace como causa biológica principal asociada a esta enfermedad. El tejido adiposo es un órgano de gran complejidad, siendo esencial para el mantenimiento de la homeostasis energética del organismo por su papel como responsable del almacenamiento del exceso de energía y su posterior movilización según demandas energéticas. Además, tras el descubrimiento de la leptina en 1994, el tejido adiposo pasó a ser reconocido como un órgano endocrino productor de hormonas, citoquinas, factores de crecimiento y factores vasoactivos, denominados en su conjunto como adipoquinas, que regulan desde la homeostasis energética, hasta la ingesta, la inflamación, la reproducción o el crecimiento celular. Si nos centramos en el tejido adiposo blanco (de aquí en adelante, denominado tejido adiposo), se distribuye fundamentalmente en dos localizaciones principales: depósito subcutáneo (SC) y depósito omental (OM), con diferencias celulares, fisiológicas, metabólicas y funcionales. Por ello, hay que destacar la importancia del estudio de las características de cada depósito del tejido adiposo ya que su distribución −independientemente de la cantidad de grasa corporal total− es un factor de riesgo para el desarrollo de las comorbilidades de la obesidad. Así, el incremento del depósito OM se asocia con un mayor riesgo cardiovascular, mientras que la acumulación de grasa en el depósito SC se relaciona con un perfil protector desde el punto de vista metabólico. No obstante, la remodelación y disfunción de cada depósito también puede contribuir a la fisiopatología de la enfermedad metabólica relacionada con la obesidad. En concreto, las alteraciones en la adipogénesis del depósito SC se han relacionado con la falta de expansibilidad de dicho tejido y, con ello, al desarrollo de las complicaciones metabólicas asociadas a la obesidad. En este contexto, el exceso de energía existente en condiciones de obesidad conlleva a una expansión patológica del tejido adiposo que conduce a otros procesos patogénicos en este tejido, entre los que se encuentran una desregulación del metabolismo glucídico y lipídico, aparición de estrés oxidativo y del retículo endoplasmático y un estado inflamatorio. Además, cuando se alcanza el límite de expansión del tejido adiposo, no es posible acumular más lípidos en este órgano, induciendo el depósito ectópico de grasa en otros tejidos involucrados en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa, un evento comúnmente definido como lipotoxicidad. La acumulación excesiva de lípidos en tejidos ectópicos conduce, en gran medida, al desarrollo de resistencia a insulina, siendo probablemente el contribuyente principal −junto a la inflamación− de la aparición de complicaciones metabólicas en los sujetos con obesidad. A pesar de las múltiples evidencias que se han encontrado sobre la relación entre la disfunción del tejido adiposo y la aparición de enfermedades metabólicas –como la obesidad, la resistencia a insulina y la diabetes tipo 2–, aún se desconocen muchos de los mecanismos subyacentes y rutas biológicas que se alteran en el tejido adiposo y promueven el desarrollo de estas condiciones patológicas. Los últimos avances en la identificación de marcadores de disfunción del tejido adiposo en obesidad y su asociación con enfermedades metabólicas han sido posibles gracias, en parte, a las técnicas ómicas, incluyendo estudios genómicos, transcriptómicos y proteómicos en modelos animales y humanos en condiciones de obesidad. En el grupo donde se ha desarrollado esta Tesis Doctoral, se han llevado a cabo varios estudios proteómicos de tejido adiposo y de sus principales componentes: fracción del estroma vascular, precursores y adipocitos que se alteran en obesidad con o sin resistencia a insulina (IR) o diabetes tipo 2 (T2D) o también, en repuesta a la pérdida de peso tras cirugía bariátrica. Sin embargo, a pesar de los avances realizados en la identificación de nuevos marcadores de la disfunción del tejido adiposo en obesidad, son necesarios nuevos estudios que estén centrados no solo en los posibles cambios cuantitativos que puedan sufrir las proteínas, sino también en su localización y, especialmente, en el estado funcional/disfuncional de dichas proteínas. En este sentido, el estudio de las modificaciones postraduccionales de las proteínas puede proporcionar vías adicionales de identificación de biomarcadores potenciales que puedan ser útiles para el establecimiento de nuevas alternativas biomédicas. Actualmente, se acepta que la diferencia en complejidad que existe entre el genoma y el proteoma se debe, en gran parte, a las modificaciones postraduccionales (MPTs) que sufren las proteínas, ya que de los 25.000 genes aproximadamente que tiene el ser humano, se codifica un número final estimado de 1 millón de proteínas. La gran mayoría de proteínas están reguladas por MPTs (fosforilación, acetilación, carbonilación…) de las que poco se sabe en el tejido adiposo en obesidad. Por ello, esta Tesis Doctoral ha tenido como objetivo explorar, identificar y caracterizar nuevos posibles marcadores del tejido adiposo regulados funcionalmente por modificaciones postraduccionales, una reversible –acetilación− y otra, irreversible – carbonilación−, e implicados en el desarrollo y progresión de enfermedad metabólica (IR y T2D) en condiciones de obesidad. En concreto, la acetilación es una de las MPTs que más se ha relacionado con la obesidad, diabetes y cáncer, así como con enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. En esta Tesis Doctoral se describe, por primera vez, el perfil de proteínas acetiladas (acetiloma) del tejido adiposo humano de los dos principales depósitos (subcutáneo y omental) bajo condiciones fisiológicas (individuos delgados) y en condiciones patológicas (obesidad y resistencia a insulina). Estos estudios muestran que el 25% del proteoma total del tejido adiposo humano está regulado por acetilación, demostrando la gran importancia que tiene esta MPT en el funcionamiento de este órgano. Al analizar el perfil de acetilación de proteínas específicas en los distintos grupos de sujetos estudiados, se observó que la obesidad y la resistencia a insulina afectan de manera depósito-dependiente a la acetilación de proteínas en el tejido adiposo. La reducción total del estado de acetilación, así como la alteración de los niveles de acetilación en enzimas clave del metabolismo energético observadas entre individuos delgados y obesos con normoglucemia (Ob-NG) o resistencia a insulina (Ob-IR), podrían contribuir a la disfunción de los adipocitos y al desarrollo de enfermedades metabólicas asociadas a la obesidad. Como se ha mencionado, el análisis del acetiloma mostró la existencia de diferentes patrones de acetilación entre los dos depósitos principales de tejido adiposo, SC y OM, destacando la complejidad molecular de este tejido. En concreto, este análisis mostró cambios en la acetilación de la chaperona lipídica y adipoquina, FABP4, en el depósito SC en relación con la resistencia a la insulina, revelando así un posible biomarcador de expansión disfuncional específica de depósito. Estudios previos han demostrado que FABP4 podría ser un marcador de resistencia a insulina debido a sus altos niveles circulantes en individuos obesos con resistencia a insulina. FABP4 interviene en la captación, almacenamiento y movilización de ácidos grasos, además de participar en la regulación transcripcional mediada por lípidos en el núcleo y ejercer una acción señalizadora como adipoquina. La alteración de FABP4 en obesidad podría relacionarse con la acumulación alterada de lípidos que ocurre en el tejido adiposo en estas condiciones, debido a su papel en la modulación del metabolismo lipídico en los adipocitos. Sin embargo, se desconoce si esta función podría estar modulada por acetilación, lo que podría ayudar a definir realmente a FABP4 como biomarcador de estas patologías. Nuestros resultados indicaron que los cambios en el perfil de acetilación de FABP4 regulan su ubicación celular y alteran las funciones intracelulares de FABP4 (control de adipogénesis y de las rutas lipolítica/lipogénica), indicando la existencia de una regulación cualitativa, más allá de la cantidad de proteína disponible, que impacta en su función. Por tanto, no solo la proteína en sí, sino también su estado de acetilación, podrían constituir dianas terapéuticas en obesidad y resistencia a insulina. or otra parte, en la patogénesis de la obesidad, resistencia a insulina y diabetes tipo 2, juega un papel fundamental el estrés oxidativo, el cual se produce como consecuencia de un acúmulo citotóxico de especies reactivas de oxígeno (ROS). El exceso de ROS provoca daño celular como consecuencia de la inducción de procesos como la peroxidación de lípidos o la carbonilación de proteínas. Así, en esta Tesis Doctoral hemos explorado este último proceso, describiendo, por primera vez, el perfil diferencial de proteínas carboniladas (carboniloma) del tejido adiposo humano de los dos depósitos de grasa, subcutáneo y omental, en sujetos con obesidad y diferente grado de sensibilidad a insulina –sujetos con obesidad y normoglucemia (Ob-NG), con obesidad y resistencia a insulina (Ob-IR) o con obesidad y diabetes tipo 2 (Ob-T2D)–. Nuestros resultados proteómicos evidenciaron diferencias específicas de depósito en el carboniloma del tejido adiposo, proporcionando nuevos conocimientos sobre la participación del tejido adiposo omental en el desarrollo de resistencia a insulina asociada a la obesidad. En concreto, nuestros resultados proteómicos mostraron un patrón de carbonilación diferencial de la transferrina entre los sujetos Ob-NG vs. Ob-IR y Ob-T2D en el depósito SC y OM, encontrando un aumento significativo de la transferrina carbonilada en pacientes Ob-IR vs. Ob-NG en el depósito OM. Adicionalmente, debido a la relación entre el metabolismo glucídico y del hierro analizamos la homeostasis del hierro en el tejido adiposo de nuestros sujetos de estudio, no encontrando diferencias significativas en el contenido de hierro total entre los grupos. Sin embargo, se encontraron cambios en la distribución del receptor de transferrina en adipocitos condiciones de exposición al ambiente existente en diabetes (i.e., exposición a medios condicionados procedentes de pacientes que desarrollan T2D) que podrían asociarse a una alteración en su unión con la transferrina. También identificamos los sitios potenciales de interacción entre transferrina y su receptor susceptibles de modificar dicha interacción. Así, nuestros estudios mostraron que la internalización del receptor de transferrina se altera en respuesta a un ambiente inductor de T2D, lo que sugiere que en el desarrollo de T2D podría contribuir, al menos en parte, la carbonilación de un residuo específico de la transferrina, P74, modificando sus propiedades electrostáticas y, por tanto, comprometiendo su unión con su receptor. En conjunto, estos resultados muestran la posible relación entre la carbonilación de proteínas y la desregulación de la homeostasis del hierro que tiene lugar en condiciones de obesidad y enfermedad metabólica. Por último, los estudios proteómicos en general, y de MPTs en particular, tienen limitaciones en cuanto a la falta de herramientas (por ejemplo, anticuerpos específicos de residuos, o inducción de MPTs en residuos específicos de proteínas concretas) que permitan profundizar para el diseño de estrategias de prevención o terapéuticas. En este contexto, la nanomedicina aparece como una línea de trabajo futuro para el diseño de estas estrategias, una línea que aún no ha sido muy explorada en relación al tejido adiposo en particular. Existe, por tanto, la necesidad de buscar nuevas estrategias metodológicas en este ámbito, tales como el uso de los quantum dots. En concreto, ya hay quantum dots conjugadas con proteínas comerciales (Qdot™ Streptavidin Sampler Kit, por ejemplo) para aplicaciones como Western blot, citometría de flujo, adquisición de imágenes por microscopía confocal e incluso en flujos de trabajo de purificación para lograr el fraccionamiento deseado. En esta Tesis Doctoral se llevó a cabo, por primera vez, un estudio comparativo in vitro totalmente paralelo del comportamiento de dos tipos de quantum dots, CQDs (carbon-based quantum dots) y SQDs (semiconductor quantum dots) en preadipocitos, como precursor del tipo celular maduro del tejido adiposo y por tanto, elemento fundamental en la expansión de dicho tejido. Nuestros resultados mostraron que las CQDs podrían ser una buena herramienta para la caracterización y posible aplicación biomédica de proteínas de interés en condiciones de obesidad y resistencia a insulina, como FABP4 o transferrina, las cuales son reguladas funcionalmente por modificaciones postraduccionales. Más aún, independientemente del tipo de nanopartícula, hay que tener en cuenta la influencia de los distintos componentes del microentorno celular (i.e, medio de cultivo), ya que pueden alterar las características sintéticas de las mismas, otorgándoles nuevas propiedades biológicas que repercuten en su comportamiento a nivel celular. Estos resultados, por tanto, abren una nueva línea de futuro para el desarrollo no solo de estudios de caracterización básicos, sino para la puesta a punto de nuevas herramientas con aplicación potencial en el campo de la obesidad.