Selection of actinomycetes strains for the control of phytopathogenic soil-borne fungi, with special reference to root rot of common bean (Phaseolus Vulgaris I.)

Abstract

The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is the most important crop for the Cuban population within the group of edible legumes with an annual production of 136,570 tonnes and yields ranging between 1.1 and 1.4 t ha-1. The environmental conditions, typical of subtropical countries, are favourable for the development and proliferation of a wide and heterogeneous soil microflora. Among them, the phytopathogenic soil-borne fungi Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani, which are associated with bean root rot disease, causing important economic losses in this crop in Cuba. The low availability of active ingredients for the control of these plant pathogenic fungi, together with their intrinsic biology, typical of soil fungi, lead us to reconsider an integrated management strategy for the proper management of the disease.

In this regard, the Centre for Bioactive Chemicals (CBQ) of the Central University "Marta Abreu" of Las Villas (UCLV) has a collection of 760 strains of bacteria classified as actinomycetes, microorganisms that have not been explored in Cuba so far as biological control agents (BCAs) with agricultural applications. Within the actinomycetes, Streptomyces is the most predominant genus in the terrestrial environment and the most studied for its properties as a biocontrol agent for plant pathogens and plant growth promoter. They are characterized by the production of biologically active primary and secondary metabolites and precursors of about 45 % of all bioactive compounds. Their enzymes allow them to chemically break down cellulose, lignin, chitin and protein-rich residues, as well as to physically bind soil particles together to form aggregates and prevent erosion.

Thus, the main objective of this PhD Thesis was to characterize 60 actinomycete strains in vitro and in vivo as BCAs against M. phaseolina and R. solani. Therefore, the first objective of this PhD Thesis was to carry out an exhaustive bibliographic review of the genus Streptomyces spp. as BCAs, with special emphasis on soil-borne pathogens.

Here, aspects related to the phenotypic, biochemical and molecular characterisation of Streptomyces, as well as their mechanisms of action and their application in crop protection, were compiled.

The Objective 2 aimed to evaluate the effectiveness of 60 actinomycete strains as BCAs against M. phaseolina and R. solani in vitro by dual culture assays. The most effective strains were characterized according to their cellulolytic, chitinolytic and proteolytic extracellular enzyme activity, as well as their morphological, biochemical and molecular characters. The results showed that 66.6% and 41.0% of the actinomycete strains significantly inhibited the mycelial growth of M. phaseolina and R. solani, respectively, compared with the control; and 30% of them showed a common effect against both pathogens. Significant differences were observed in their enzymatic and biochemical activity. Morphological and biochemical characters allowed us to identify all the strains as species belonging to the genus Streptomyces. Two Streptomyces strains, CBQ-EA-2 and CBQ-B-8, showed the highest effectiveness in vitro. Finally, the effect of seed treatments with both strains (CBQ-EA-2 and CBQ-B-8), using single or mixed applications, against the disease development was evaluated on seedlings of P. vulgaris cv. Quivicán grown in pots filled with soils inoculated with M. phaseolina and R. solani.

Treatments combining the two Streptomyces strains (CBQ-EA-2 + CBQ-B-8) were able to significantly reduce the disease incidence and severity for both pathogen infections compared to the nontreated and inoculated control. Furthermore, they showed a similar effect to that observed for the BCA Trichoderma harzianum A-34 and the chemical Celest® Top 312 FS (Syngenta®; Basel, Switzerland) treatments, which were included for comparative purposes.

The Objective 3 was carried out to validate the results of the Objective 2 in three experimental fields with soils naturally infested by M. phaseolina and R. solani. In all experimental fields, significant differences in disease incidence and severity were observed between treatments compared to the nontreated controls. Overall, single treatments with Streptomyces sp. strain CBQ-EA-2 or Streptomyces sp. strain CBQ-B-8 showed significantly less effect in reducing disease incidence and severity than treatments combining the two strains (Streptomyces sp. CBQ-EA-2+ CBQ-B-8), regardless the experimental field. The three treatments with Streptomyces spp. were significantly more effective than those with Celest® Top 312 FS; in contrast, most of the Streptomyces treatments had a significantly lower effect than the BCA T. harzianum A-34. When we evaluated the yield and quality of the legumes, in general, the treatment combining the two strains (Streptomyces sp. CBQ-EA-2+ CBQ-B-8) showed similar results with the chemical Celest® Top 312 FS and with the BCA T. harzianum A-34.

Finally, the objective 4 was a complementary study carried out during a 6-month pre-doctoral stage at the University of Cordoba (Spain). The goal lof this work was to evaluate the effect of six of the most effective Streptomyces strains from the Objective 1 as BCAs against Verticillium wilt of olive caused by Verticillium dahliae, one of the main olive diseases in Spain. For this purpose, trials were carried out under controlled conditions using two isolates of Verticillium dahliae (V-004 and V-323), evaluating the effect of the Streptomyces strains on mycelial growth of the pathogen by dual culture as well as their effect on the viability of conidia and microsclerotia of the pathogen in vitro.

In addition, their effect on the disease development was determined in olive plants inoculated with V. dahliae isolate V-323. The six Streptomyces sp. strains and the two BCAs F. oxysporum FO12 and A. pullulans AP08 used as effective control showed a significant effect on mycelial growth inhibition for both V. dahliae isolates V-004 and V- 323 compared to the untreated control. The reference BCA FO12 was the most effective on mycelial growth inhibition followed by AP08 for the two V. dahliae isolates; while the Streptomyces sp. strains showed a moderate effect for both V. dahliae isolates. Among the Streptomyces strains evaluated, CBQ-EA-2 was the most effective inhibiting mycelial growth of V. dahliae.

The result generated through this PhD Thesis represents an important advance in the biocontrol of soil-borne pathogens of two crops, common bean and olive, of global economic importance through the use of Streptomyces spp. strains, which had not been previously explored in the two geographical areas where this PhD Thesis has been developed.

La judía común (Phaseolus vulgaris L.) es la especie vegetal más importante para la población cubana dentro del grupo de las leguminosas comestibles con una producción anual de 136.570 toneladas y rendimientos que oscilan entre 1,1 y 1,4 t ha-1. Las condiciones ambientales, típicas de países subtropicales, son favorables para el desarrollo y la proliferación de una amplia y heterogénea microflora del suelo, entre la que destacan los hongos fitopatógenos de suelo Macrophomina phaseolina y Rhizoctonia solani, asociados con la podredumbre de raíces de la judía, y que causan importantes pérdidas económicas en este cultivo en Cuba. La baja disponibilidad de materias activas para el control de estos hongos fitopatógenos, unida a su biología intrínseca, propia de hongos del suelo, nos conducen a replantearnos una estrategia de gestión integrada para el manejo adecuado de estas enfermedades. En tal sentido, el Centro de Bioactivos Químicos (CBQ), de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas (UCLV), cuenta con una colección de 760 cepas de bacterias clasificadas como actinomicetos, microorganismos no explorados en Cuba hasta el momento como agentes de control biológico (ACBs) con aplicaciones agrícolas. Dentro de los actinomicetos, Streptomyces es el género más predominante en el medio terrestre y el más estudiado por sus propiedades como agente de biocontrol de fitopatógenos y promotor del crecimiento de las plantas. Estos microorganismos se caracterizan por producir metabolitos primarios y secundarios, biológicamente activos y precursores de cerca del 45% de todos los compuestos bioactivos. Sus enzimas les permiten descomponer químicamente la celulosa, la lignina, la quitina y los residuos ricos en proteínas, así como unir físicamente las partículas del suelo para formar agregados y evitar la erosión. Así, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue caracterizar in vitro e in vivo 60 cepas de actinomicetos como ACBs frente a M. phaseolina y R. solani. Para ello, el primer objetivo de esta Tesis Doctoral fue realizar una exhaustiva revisión bibliográfica del género Streptomyces spp. como ACBs, con especial énfasis en patógenos de suelo, igualmente, se resumen aspectos relacionados con la caracterización fenotípica, bioquímica y molecular de Streptomyces, así como sus mecanismos de acción y su aplicación en la protección de cultivos. El objetivo 2 fue evaluar la eficacia de 60 cepas de actinomicetos como ACBs frente a M. phaseolina y R. solani in vitro mediante ensayos de cultivo dual. Las cepas más eficaces se caracterizaron de acuerdo con su actividad enzimática extracelular celulolítica, quitinolítica y proteolítica, así como por sus caracteres morfológicos, bioquímicos y moleculares. El 66,6 % y 41,0 % de las cepas de actinomicetos inhibieron el crecimiento micelial de M. phaseolina y R. solani, respectivamente, y 30 % de ellas mostraron un efecto común contra ambos patógenos. Se observaron diferencias significativas en su actividad enzimática y bioquímica. Los caracteres morfológicos y bioquímicos permitieron identificar todas nuestras cepas como pertenecientes al género Streptomyces. Las cepas Streptomyces CBQ-EA-2 y CBQ-B-8 mostraron la mayor eficacia in vitro. Por último, se evaluó el efecto de los tratamientos de semillas con ambas cepas sobre M. phaseolina y R. solani en plántulas de P. vulgaris cv. Quivicán. Los tratamientos que combinan las dos cepas de Streptomyces (CBQ-EA-2 + CBQ-B-8) fueron capaces de reducir significativamente la enfermedad causada por ambos patógenos en comparación con el control no tratado e inoculado. Además, mostraron un efecto similar al observado con Trichoderma harzianum A-34 y con los tratamientos Celest® Top 312 FS (Syngenta®; Basilea, Suiza), que se incluyeron con fines comparativos. El objetivo 3 se llevó a cabo para validar los resultados anteriores en tres campos experimentales con suelos naturalmente infestados por M. phaseolina y R. solani. En todos los campos experimentales, se observaron diferencias significativas (P < 0,05) en la incidencia y severidad de la enfermedad entre los tratamientos en comparación con los controles no tratados. En general, los tratamientos con Streptomyces sp. cepa CBQ-EA-2 o Streptomyces sp. cepa CBQ-B-8 solos mostraron un efecto significativamente menor en la reducción de la incidencia y la severidad que los tratamientos que combinaban las dos cepas (Streptomyces sp. CBQ-EA-2+ CBQ-B-8), independientemente del campo experimental. Los tres tratamientos con Streptomyces spp. resultaron significativamente más eficaces que los realizados con el producto químico Celest® Top 312 FS; por el contrario, la mayoría de los tratamientos con Streptomyces tuvieron un efecto significativamente menor que el ACB T. harzianum A-34. Cuando se evaluaron el rendimiento y calidad de las legumbres, en general, el tratamiento combinando las dos cepas (Streptomyces sp. CBQ-EA-2+ CBQ-B-8), mostró resultados similares con el producto químico Celest® Top 312 FS y con T. harzianum A-34. Por último, el objetivo 4 fue un estudio complementario realizado durante una estancia predoctoral de 6 meses en la Universidad de Córdoba (España). En este trabajo se evaluó el efecto de seis de las cepas de Streptomyces más efectivas del Objetivo 1 como ACBs frente a la Verticilosis del olivo causada por Verticillium dahliae, una de las principales enfermedades del olivar en España. Para ello, se llevaron a cabo ensayos en condiciones controladas empleando dos aislados de V. dahliae (V-004 y V-323), evaluando el efecto de las cepas sobre el crecimiento micelial del patógeno mediante cultivo dual, así como su efecto en la viabilidad de conidios y microesclerocios del patógeno in vitro. Además, se determinó su efecto frente al desarrollo de la enfermedad en plantas de olivo, empleando en este caso el aislado V-323 de V. dahliae. Las seis cepas de Streptomyces sp. y los dos ACBs F. oxysporum FO12 y A. pullulans AP08 utilizados como controles efectivos mostraron un efecto significativo sobre la inhibición del crecimiento micelial los dos aislados de V. dahliae V-004 y V-323 en comparación con el control no tratado. El ACB de referencia FO12 fue el más eficaz sobre la inhibición del crecimiento micelial seguido de AP08 para los dos aislados de V. dahliae; mientras que las cepas de Streptomyces sp. mostraron un efecto moderado, para ambos aislados de V. dahliae. De las cepas de Streptomyces sp evaluadas, fue CBQ-EA-2 la que mostró los mejores resultados en la inhibición del crecimiento micelial de V. dahliae. El resultado generado a través de esta Tesis Doctoral representa un avance importante en el biocontrol de patógenos de suelo de dos cultivos de importancia económica mundial mediante el uso de cepas de Streptomyces spp., no explorado previamente en las dos zonas geográficas donde se ha desarrollado esta Tesis Doctoral.