Mecanismos reguladores en la asimilación de distintas fuentes de nitrógeno, orgánica e inorgánica, en el organismo modelo Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

Algae are photosynthetic organisms that thrive in a great variety of ecosystems. These organisms are the dominant primary producers on our planet and have essential roles in O2 production, CO2 fixation, nitrogen (N) cycle, and the stabilization of different ecosystems. However, their high proliferation capacity under excess nutrient conditions, like those present in contaminated aquatic niches, can cause the eutrophication of ecosystems. From a biotechnological perspective, some algae are very relevant due to their nutritional and nutraceutical interest, as well as their capacity to produce highvalue products. Chlamydomonas reinhardtii is a green microalga that has arisen as a model organism, helping understand many biological processes at the molecular level, including nitrogen (N) assimilation. This microalga has also been used to understand algal-bacteria mutualistic interactions based on carbon and nitrogen exchange. Moreover, Chlamydomonas reinhardtii has emerged as an important biotechnological tool in bioremediation and biofuel production. Like plants, Chlamydomonas can use inorganic ammonium (NH4 +), nitrate (NO3 -), and nitrite (NO2 -) and organic (amino acids, urea, uric, etc.) nitrogen. However, there exists a preference for some forms of N over the others, which is controlled by complex regulatory mechanisms. Furthermore, under excess N (mainly NO2 -), microalgae can generate the greenhouse gas nitrous oxide (N2O). In this thesis dissertation, we studied the impact of NO3 - as a nutrient or signal molecule on different processes in Chlamydomonas. First, we studied NO3 -/NO2 - dissimilation to N2O (Chapter 1). Second, we tackled the role of NO3 - as a signal molecule in regulating organic N assimilation and accumulation of starch, lipids, carotenoids, and chlorophyll (Chapter 2). Finally, a transcriptomic analysis and a study of promoters and Transcription Factors (TFs) have allowed us to elucidate new regulatory roles mediated by NO3 -/NIT2 (Chapter 3). Chapter 1. Nitrous oxide (N2O) is a potent greenhouse gas whose emisión rate has increased during the last decades, mainly due to anthropogenic causes. To study NO3 -/NO2- dissimilation by green microalgae, we set the following goals. 1) Identification of genes involved in this process (NIRK, CYP55, FLV, and HCP) present in different algal genomes, and 2) the validation of a strategy to enhance and study the dissimilation pathway in Chlamydomonas. With this purpose, we have used CRDS (Cavity Ring-Down Spectroscopy), which allows the continuous measurement of N2O and CO2 in Chlamydomonas strains lacking NO2 - reductase activity (NiR). This strategy dramatically increased N2O production and allowed us to study the role of NIT2 (the master regulator of nitrate assimilation), NIT1/NIA1 (nitrate reductase (NR), ARC/NOFNiR (a protein involved in NR-dependent NO synthesis from NO2 -), CYP55 (mitochondrial NO reductase), and FLV (chloroplast NO reductase) in this process. The results presented in this Chapter show that the NR/ARC complex greatly impacts N2O emissions, in both light and darkness, by affecting NO accumulation. Furthermore, our data highlight that CYP55 and FLV are required for N2O emissions in light and dark conditions. The need for both proteins and the different subcellular locations of FLV and CYP55 suggest a crosstalk between mitochondria and chloroplast in this process. This section also studied how variations in the capability to synthesize N2O affected CO2 emissions. Chapter 2. NO3 - role as a signal, independent of its assimilation and mediated by NIT2, has been analyzed in a Chlamydomonas strain lacking NO3 - reduction capability. This strain cannot grow in NO3 - but can take it up, impacting numerous processes. Our results indicate that intracellular NO3 - is involved in gametogenesis inhibition, blocking organic N assimilation, preventing chlorophyll degradation, protecting photosynthetic activity, promoting a more pronounced starch synthesis, and exhibiting a reduced accumulation of TriAcylGlyceride (TAG). The maintenance of DGDG (DiGalactosylDiacylGlycerol; a lipid of the thylakoid membrane) and photosynthetic pigments (carotenoids and chlorophyll) in the presence of non-assimilable NO3 - indicates that NO3 - /NIT2 are relevant players in the protection of the photosynthetic apparatus. The same strain that cannot grow in organic N in the presence of NO3 – has allowed us to isolate mutants affected in a signaling component, still unknown, which lose the repression and recover the ability to grow in organic N in the presence of NO3 -. Chapter 3. In this Chapter, a transcriptomic analysis in the presence of NO3 and in different strains was performed, allowing us to complement the studies of those genes showed in Chapters 1 and 2. In addition, the expression patterns of genes positive and negatively regulated by NO3 - and NIT2 have been assessed, including those involved in NO2 - dissimilation and organic N assimilation. Finally, the analysis of different promoters and the expression patterns of some TFs has allowed us to propose a regulatory model for some of the studied pathways.

Las algas son organismos fotosintéticos presentes en una gran diversidad de ecosistemas. Estos organismos son los productores primarios dominantes en la tierra y tienen un papel primordial en la producción de O2, fijación de CO2, ciclo del nitrógeno (N) y en la estabilización de los ecosistemas. Sin embargo, su alta capacidad de proliferación en condiciones de exceso de nutrientes, como las producidas por la contaminación de diferentes nichos acuáticos, también es la causa de la eutrofización de estos ecosistemas. Desde un punto de vista biotecnológico, algunas algas tienen un alto valor debido a su interés alimenticio, nutracéutico y su capacidad de producir compuestos de valor añadido. Chlamydomonas reinhardtii es una microalga verde que se ha desarrollado como un organismo modelo y que ha permitido conocer a nivel bioquímico, genético y molecular una gran cantidad de procesos biológicos, entre los que destacamos la asimilación de nitrógeno (N). Esta microalga también ha permitido abordar las bases para entender las interacciones mutualistas con bacterias, basadas en el intercambio de carbono (C) por nitrógeno. En las últimas décadas, Chlamydomonas también ha emergido como un organismo con un gran potencial biotecnológico en procesos de biorremediación y producción de biocombustibles. Chlamydomonas, al igual que las plantas, puede utilizar fuentes de N inorgánico como amonio (NH4 +), nitrato (NO3 -) y nitrito (NO2 -) y orgánico (aminoácidos, urea, úrico, etc.). Sin embargo, existe una preferencia de unas formas de N sobre otras, que obedece a mecanismos reguladores. Además, en condiciones de exceso de N (fundamentalmente NO2 -), las algas pueden generar el gas de efecto invernadero óxido nitroso (N2O). En este trabajo hemos intentado avanzar en el estudio de cómo el NO3 -, como nutriente o como molécula señal, impacta en otras rutas en Chlamydomonas. En primer lugar, estudiamos la desasimilación de NO3 -/NO2 - a N2O (Capítulo 1). En segundo lugar, abordamos el papel del NO3 -, como molécula señal, sobre la asimilación del nitrógeno orgánico, la acumulación de almidón, lípidos, compuestos carotenoides, y clorofila (Capítulo 2). Finalmente, un análisis transcriptómico, junto con un estudio de promotores y de factores de transcripción, nos ha permitido sugerir nuevos papeles reguladores mediados por NO3- y NIT2 (Capítulo 3). Capítulo 1. El óxido nitroso (N2O) es un potente gas de efecto invernadero cuya producción y liberación está aumentado considerablemente durante las últimas décadas, en gran parte por causas antropogénicas. Para el estudio de la desasimilación de NO3 -/NO2 - hasta N2O por microalgas, nos hemos planteamos los siguientes objetivos. 1) Búsqueda de genes implicados en dicho proceso que estén presentes en los genomas de algas (NIRK, CYP55, FLV y HCP) y el establecimiento/validación de una estrategia para estudiar la desasimilación de NO3 -/NO2 - a N2O en Chlamydomonas. Para ello se ha utilizado la metodología de espectroscopia CRDS (Cavity Ring-Down Spectroscopy) que permite monitorizar las concentraciones de N2O y CO2, de forma continua, y hemos usado estirpes de Chlamydomonas en las que se ha interrumpido la asimilación de NO3 -/NO2 - mediante la mutación NO2 - reductasa (NiR). Esto nos ha permitido conocer el papel de diferentes actores involucrados en este proceso de desasimilación como son NIT2 (el regulador maestro de la asimilación de NO3 -); NIT1/NIA1 (NO3 - reductasa), ARC/NOFNiR (Nitrito reductasa formadora de NO que funciona junto a la NR), CYP55 y FLV (NO reductasas, mitocondrial y cloroplástica, respectivamente). Los resultados han permitido proponer que el complejo NR/ARC tiene un gran impacto en las emisiones de N2O tanto en luz como en oscuridad, a través de la producción de NO. Que ambas CYP55 y FLV son necesarias, como NO reductasas, para que se produzcan altas emisiones de N2O. Dado que FLV y CYP55 tienen localizaciones diferentes, se sugiere que debe existir una coordinación mitocondria-cloroplasto para dicho proceso. Además, en este Capítulo hemos estudiado cómo estas condiciones que favorecen la producción de N2O impactan en el metabolismo central de las algas y afectan las emisiones de CO2. Capítulo 2. El papel de NO3 - como señal, independiente de su asimilación, se ha estudiado en estirpes de Chlamydomonas que no pueden reducir NO3 - a NO2 -, pero donde se genera una situación diferente a la falta de N. Los resultados indican que muchos de estos efectos del NO3 - están mediados por el gen regulador NIT2 y determinan una inhibición de la gametogénesis, inhibición de la asimilación de formas de nitrógeno orgánico, evita la degradación de la clorofila y permite mantener una actividad fotosintética apropiada, y a la vez sintetizar más almidón, pero menos triacilglicéridos (TAGs). El mantenimiento de los niveles de DGDG (DiGalactosylDiacylGlycerol; un lípido de la membrana del tilacoide), compuestos carotenoides y clorofila apoyan al efecto de NO3 - /NIT2 en la protección del aparato fotosintético. En presencia de NO3 -, la estirpe carente de NR está impedida para asimilar fuentes orgánicas de N. El trabajo realizado en este Capítulo nos ha permitido aislar mutantes afectados en un componente de señalización, aún por identificar, cuya alteración permite revertir específicamente la regulación negativa por NO3 - /NIT2 para la asimilación de N orgánico. Capítulo 3. En este Capítulo, se ha realizado un análisis transcriptómico que nos ha permitido estudiar los niveles de transcritos de aquellas rutas que se han estudiado en los Capítulos 1 y 2. Se han determinado los patrones de expresión de genes que estarían regulados positiva y negativamente por NO3 - y NIT2, entre los que se incluyen los implicados en la desasimilación de NO2 - y la asimilación de N orgánico. Finalmente, un análisis de promotores y estudio de expresión de Factores de Transcripción (FTs) en respuesta a NH4 +, NO3 - o deficiencia de nitrógeno, ha permitido proponer modelos de regulación para algunas de las rutas estudiadas.