Mecanismos genéticos y moleculares implicados en la compensación proteica en el grano de trigo: Implicaciones para la obtención de variedades con bajo contenido en gluten inmunogénico

Abstract

Prolamins, or gluten proteins, play an important role in the bread-making quality of wheat. These proteins are divided into two main fractions: gliadins and glutenins. In addition to their viscoelastic properties, gluten proteins are responsible for triggering the autoimmune-response in patients suffering from celiac disease (CD), a chronic enteropathy given in genetically predisposed individuals that affects 0.7% of the global population. The only available treatment is to follow a life-long gluten-free diet, which is difficult due to the large number of products that are based on wheat or present it as an additive. Biotechnological tools have been applied to obtain wheat varieties with lowgluten content. RNA of interference (RNAi) has been one of those, providing the silencing of the three groups of gliadins: ω-, α- and γ-gliadins. The synthesis of gluten proteins is influenced by the environment: among the factors that affect the grain composition, temperature and nitrogen (N) stand out, especially during the grain-filling stage. In the second chapter of this thesis, gliadins and glutenins from four RNAi lines with low-gluten content have been studied under heat stress and two nitrogen (N) treatments. Quantification was performed by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). In addition to the effect of heat stress decreasing grain weight in all the lines tested, an increase in the prolamin content was observed in the control lines (without the silencing fragment) due to temperature. Except for ω-gliadins, the rest of the prolamins of the RNAi lines did not present any effect on their content in the environmental conditions tested, while the proteins of the control lines were affected. This indicates great stability of the silencing character in the RNAi lines, which gives them value in the context of increased temperature and heat stress events, and environments with different N availability. In this work, as well as in previous ones, the RNAi lines showed a total grain N content similar to that of the control lines, despite the great decrease in the gliadin content. This phenomenon of compensation or readjustment of the grain protein composition gave rise to the next two chapters. The third chapter presents the results of gene expression by RT-qPCR and RNAseq from two RNAi lines with two different endosperm promoters driving the silencing fragment. In both lines, the compensation was produced by the increase in the nongluten proteins (NGPs) and the high molecular weight (HMW) subunits of glutenins. The increase in the expression of the genes that encode these subunits is already notable in the RNAi lines at 18 days after anthesis (DAA), as well as the transcription factors (TFs) related to the regulation of prolamins synthesis. In addition, the expression of genes encoding NGPs (globulins, serpins, ns-LTPs, and triticins) was also higher in the RNAi lines. Moreover, other changes at the transcriptome level were observed in the RNAi lines, particularly those related to enzyme regulation activity, carbohydrate metabolism, and stress response. Regarding the latter, many of the genes differentially expressed in the RNAi lines involved in this process are regulated by the abscisic acid (ABA), which could suggest the involvement of this phytohormone in the stress response observed at the expression level in the RNAi lines.

Las prolaminas, o proteínas del gluten, tienen un papel fundamental en la calidad harino-panadera del trigo. Estas proteínas se dividen en dos grandes fracciones: gliadinas y gluteninas. Además de sus propiedades viscoelásticas, las proteínas del gluten son las responsables de desencadenar la respuesta autoinmune en pacientes con enfermedad celíaca (EC), una enteropatía crónica en individuos genéticamente predispuestos que afecta al 0.7% de la población mundial. El único tratamiento posible es seguir una dieta libre de gluten de por vida, lo que resulta difícil debido a la gran cantidad de productos basados en trigo o que lo presentan como aditivo. La aplicación de herramientas biotecnológicas ha permitido obtener variedades de trigo con bajo contenido en gluten. El ARN de interferencia (ARNi) ha sido una de las utilizadas, teniendo como objetivo las tres fracciones de gliadinas: ω-, α- y γ. La síntesis de estas proteínas está influenciada por el ambiente: entre los factores que afectan a la composición del grano, destacan la temperatura y la disponibilidad de nitrógeno (N), especialmente durante el estadio de llenado del grano. En el segundo capítulo de este trabajo, gliadinas y gluteninas de cuatro líneas ARNi con bajo contenido en gluten han sido cuantificadas bajo estrés térmico y dos tratamientos de N. La cuantificación se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC, de sus siglas en inglés). Además del efecto del estrés térmico disminuyendo el peso del grano en todas las líneas ensayadas, se observó un incremento de las prolaminas en las líneas control (sin el fragmento de silenciamiento) debido a la temperatura. A excepción de las ω-gliadinas, el resto de las prolaminas de las líneas ARNi no se vieron afectadas por los cambios ambientales ensayados, mientras que estos sí influyeron en las proteínas de las líneas control. Esto indica una gran estabilidad del carácter de silenciamiento en las líneas ARNi, lo que las pone en valor en un contexto de cambio climático con incremento de temperatura y eventos de estrés térmico, y ambientes con distinta disponibilidad de N. En este trabajo, así como en otros anteriores, las líneas ARNi presentaron un contenido de N total en el grano similar al de las líneas control, pese a la gran disminución en el contenido de gliadinas. Este fenómeno de compensación o reajuste de la composición proteica del grano dio lugar a los dos siguientes capítulos. En el tercer capítulo se exponen los resultados del análisis de la expresión génica mediante RT-qPCR y RNA-seq de dos líneas ARNi con silenciamiento de gliadinas donde el fragmento de silenciamiento estaba bajo el control de dos promotores de endospermo distintos. En ambas líneas, la compensación se produjo por el incremento de las proteínas no pertenecientes al gluten (NGPs, de sus siglas en inglés) y de las subunidades de gluteninas de alto peso molecular (HMW, de sus siglas en inglés). El incremento de la expresión de los genes que codifican estas subunidades ya es notable en las líneas ARNi a los 18 días después de la antesis (DAA, de sus siglas en inglés), al igual que factores de transcripción (FTs) relacionados con la regulación de la síntesis de las prolaminas. Además, la expresión de los genes que codifican para las NGPs (globulinas, serpinas, ns-LTPs y triticinas) también fue mayor en las líneas con silenciamiento de gliadinas. También se observaron otros cambios a nivel de transcriptoma en las líneas ARNi, particularmente los relacionados con la regulación de la actividad enzimática, el metabolismo de los carbohidratos y la respuesta a estrés. En relación con este último, muchos de los genes implicados en este proceso, y diferencialmente expresados en las líneas ARNi, están regulados por el ácido abscísico (ABA), lo que podría sugerir la implicación de esta fitohormona en la respuesta a estrés observada a nivel de expresión en las líneas ARNi. El transcriptoma de otra línea ARNi con fuerte silenciamiento de todas las fracciones de gliadinas fue analizada en el cuarto capítulo. En esta ocasión se escogió la línea E82 para el análisis de expresión diferencial y se tomaron muestras de dos tejidos: el grano y la hoja en un estadio intermedio del llenado del grano. La línea E82 es una de las líneas ARNi con mayor reducción de gluten (ppm) y que, además, ha sido utilizada en ensayos clínicos con pacientes celíacos y sensibles al trigo. En este trabajo, el foco se puso principalmente en los elementos reguladores a nivel transcripcional, obteniéndose así una red de FTs candidatos a regular la síntesis de las proteínas de reserva de la semilla, incluyendo las prolaminas, y el almidón en el grano en las líneas ARNi. Tanto los genes codificantes de los FTs de la red, como los de las prolaminas y otras proteínas de reserva del grano, estuvieron subexpresados en la línea E82. Los resultados obtenidos en la hoja de la línea ARNi mostraron una gran cantidad de genes subexpresados relacionados con la actividad de las proteasas, el metabolismo de los amino-ácidos y de los azúcares, y su transporte. En relación a este último, cabe destacar que los transportadores específicos de prolina estuvieron subexpresados en la línea E82, mientras que los de lisina-histidina estuvieron sobreexpresados. Además del menor contenido en gluten, esta línea difiere de las analizadas en el capítulo anterior en que la compensación proteica en el grano se produce principalmente por las NGPs, concretamente las globulinas ricas en lisina, y no por las HMW. Los genes que codifican para las globulinas no estuvieron subexpresados en la línea ARNi ni presentaron relación alguna con la red de FTs, sugiriendo que son reguladas independientemente del resto de proteínas de reserva en el grano. Tanto la red de FTs descrita como la información relativa a las globulinas y los procesos en la hoja, contribuyen a incrementar el conocimiento relativo a la regulación de las prolaminas y la compensación proteica en las líneas con silenciamiento de las gliadinas. Además del ARNi, se ha utilizado la tecnología CRISPR/Cas para la obtención de líneas con bajo contenido en gluten. Debido a la complejidad de las regiones genómicas que codifican los genes de prolaminas y a que no todo el gluten es igual de inmunogénico, la caracterización de estas regiones es importante para diseñar programas de mejora genética de precisión, tanto tradicionales como basados en las nuevas herramientas de mejora como CRISPR/Cas. Con este objetivo se realizó el quinto capítulo, donde los complejos inmunogénicos de las - y -gliadinas fueron caracterizados mediante secuenciación masiva en un conjunto de líneas de trigo harinero, trigo duro y tritórdeo, incluyendo líneas de trigo con la translocación de centeno 1BL/1RS. Se identificaron y cuantificaron los epítopos y péptidos inmunogénicos relacionados con la EC en los amplicones de las α- y γ-gliadinas, incluyendo también las 40k-γ-secalinas. Los resultados de este capítulo permitieron conocer la complejidad estructural de estos complejos inmunogénicos en trigo, y clasificar las líneas con mayor y menor potencial inmunogénicos, así como cuantificar la abundancia de los epítopos relacionados con le EC, incluyendo el 33-mer, uno de los péptidos más inmunodominantes que se conocen. Estos resultados permitirán seleccionar variedades y su incorporación en programas de mejora genética clásica o su uso directo mediante edición genética con CRISPR/Cas.