Effects of symbiotic N fixation on N and water use efficiency in common bean plants: physiological, molecular and biochemical characterization

Abstract

La judía común (Phaseolus vulgaris) es uno de los cultivos con mayor importancia, no solo por su alto valor nutricional, sino también medioambiental, ya que, como leguminosa, la judía común tiene la capacidad de fijar el N atmosférico (N2) en sus nódulos radiculares, disminuyendo así el uso de fertilizantes y su consecuente emisión de gases de efecto invernadero. Sin embargo, la fijación de N2 es particularmente sensible a diferentes condiciones adversas como la sequía, cuyos efectos se están agravando por el cambio climático. Por tanto, estudiar los efectos de la sequía en los cultivos de estas leguminosas es de especial relevancia en regiones áridas como Andalucía (España), donde la disponibilidad de agua es cada vez más escasa y siendo este uno de los factores que más limitan su productividad. El presente trabajo de tesis está organizado en 4 capítulos en los cuales se estudia la regulación a nivel molecular, bioquímico y fisiológico de los mecanismos de defensa de las plantas de P. vulgaris frente al estrés hídrico. Recientemente, el desarrollo de tecnologías -ómicas, que permiten evaluar cambios moleculares a gran escala, se ha convertido en una herramienta de gran utilidad para la evaluación de la respuesta al estrés en plantas. Por tanto, en el capítulo 1 se analizaron los cambios transcriptómicos (RNAseq) en respuesta al estrés hídrico en una variedad local de P. vulgaris (PHA-0683) resistente a la sequía. Para ello se utilizó tejido foliar de plantas control y plantas sometidas a 10 días de sequía, cultivadas en condiciones de fijación de N2. El análisis mostró la disminución de la expresión de genes asociados con la inhibición de la respuesta del ácido abscísico (ABA), la principal hormona de respuesta al estrés en la planta. Además, la prevalencia los genes expresados diferencialmente (DEG) relacionados con la respuesta a la carencia de fosfato (P) y el análisis fisiológico de plantas PHA-0683 en respuesta a sequía con diferentes concentraciones de P, demostraron que, entre los mecanismos de tolerancia de esta variedad está, precisamente, la capacidad de movilizar fosfato en condiciones de estrés. La domesticación, la expansión global y las prácticas agrícolas locales han implicado el desarrollo de una amplia variedad de líneas o genotipos de judía común con diferentes grados de resistencia al estrés hídrico. Por lo que en el capítulo 2 se llevó a cabo la comparación de la respuesta molecular y fisiológica al estrés hídrico de dos variedades de judía. Para ello se utilizaron la variedad local de P. vulgaris (PHA-0683), con un alto grado de tolerancia a los periodos de sequía, y una línea comercial (PMB-0220) de tolerancia intermedia a la sequía, pero mayor productividad. La comparación mostró que mientras la variedad local, PHA-0683, mantenía relativamente estables sus parámetros fisiológicos en respuesta a diez días de falta de riego, la variedad PMB-0220 disminuía su contenido hídrico foliar, su biomasa aérea y el contenido en clorofilas en las hojas más viejas. El análisis de los niveles de expresión de genes relacionados con la respuesta al ABA y de varios factores de transcripción que regulan la senescencia en la planta, demostró que había claras diferencias cualitativas y cuantitativas en los patrones de expresión de varios de estos reguladores en respuesta a la sequía entre las dos variedades. Con el fin de incrementar la tolerancia a la sequía en cultivos de judía más productivos, en el capítulo 3 se analizó de forma más completa la respuesta al estrés hídrico en plantas de la línea comercial PMB-0220 que es menos tolerante a la sequía que PHA-0683, pero tiene mayor productividad. A pesar de las ventajas que supone cultivar leguminosas como la judía común en condiciones de fijación de N2, muchos agricultores prefieren el uso de fertilizantes nitrogenados que aseguren una buena cosecha. En este capítulo se estudió la respuesta a la sequía en plantas de judía PMB-02202 cultivadas con nitrógeno inorgánico procedente de la fertilización, o en condiciones de simbiosis y fijación de nitrógeno. Para ello, en este capítulo se combinaron análisis transcriptómicos y metabolómicos con los análisis fisiológicos. El estudio de la expresión diferencial de genes mostró que las plantas cultivadas con fijación de N2 tenían mayor expresión de genes asociados con la síntesis de ABA y de respuesta al estrés hídrico, incluso en ausencia de estrés, comparadas con las plantas fertilizadas con NO3-. Así mismo, también se observó la inducción de genes relacionados con el metabolismo de los azúcares solubles y el mantenimiento del balance osmótico en plantas fijadoras de N2 y sometidas a sequía. El análisis metabolómico confirmó que las plantas en simbiosis y sometidas a 10 días de sequía también acumulaban mayor concentración de metabolitos de defensa a la sequía, como la propia hormona ABA y ureidos (alantoína), azúcares solubles, y otros metabolitos que mantienen el balance osmótico en la planta como rafinosa y prolina, además de diversos lípidos que ayudan en el mantenimiento de la fluidez de las membranas. Por último, el estudio fisiológico confirmó que las plantas fijadoras de N2 mantenían mejor el contenido hídrico foliar y estaban mejor adaptadas que las plantas fertilizadas con NO3 -. En este capítulo 3, también se realizó un experimento de recuperación tras el tratamiento de estrés hídrico, en el que las plantas volvieron a regarse después de los 10 días de sequía y se cultivaron hasta el momento de la recogida de frutos. Tras la rehidratación, las plantas en fijación de N2 recuperaron el intercambio de gases, tasa de fotosíntesis y la producción de frutos, mientras que las plantas fertilizadas con NO3 - no consiguieron recuperarse de la sequía, mantuvieron valores reducidos de intercambio de gases y fotosíntesis a pesar de la rehidratación y disminuyeron la productividad de su cosecha. Varios estudios han indicado el papel positivo de los ureidos en diferentes situaciones de estrés. Los nucleótidos de purina, precursores de los ureidos, pueden sintetizarse mediante la síntesis de novo u obtenerse mediante vías de reciclaje de las bases de purina. Dos enzimas son las responsables del reciclaje de purinas, la adenina fosforribosiltransferasa (APRT) que cataliza el reciclaje de adenina y la hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) que cataliza el reciclaje de guanina e hipoxantina. En el capítulo 4 se aborda la caracterización molecular, bioquímica y funcional de la primera de estas dos enzimas. La adenina fosforribosiltransferasa está codificada por cuatro genes en P. vulgaris. El análisis filogenético de las secuencias, así como también la sobreexpresión de las cuatro proteínas fusionadas a -YFP (Yellow fluorescent protein) en plantas de Nicotiana benthamiana, reveló que las APRTs de judía se agrupaban en dos “clusters”, dos de las cuatro proteínas tienen localización cloroplástica, mientras que las otras dos se localizan en el citosol. La caracterización bioquímica, el patrón de expresión génica y los niveles de actividad en los diferentes tejidos de P. vulgaris mostraron que PvAPRT1 y PvAPRT5 eran las proteínas predominantes y que, curiosamente, tenían altos niveles de expresión en raíz y nódulos. Con el fin de dilucidar el papel específico que llevan a cabo estas isoformas, se generaron raíces mutadas en cada uno de los dos genes mediante edición génica usando la tecnología CRISPR/Cas9. Finalmente, el análisis fisiológico y metabolómico de estas raíces transgénicas reveló que, si bien el gen PvARPT1 actúa principalmente en la vía de reciclaje de la adenina, el gen PvAPRT5 participa en la regulación de los niveles de citoquininas, modificando el crecimiento de la raíz y los nódulos de la planta. Además, tanto los datos transcriptómicos de los capítulos anteriores, como los perfiles metabolómicos de las raíces con mutaciones en los genes que codifican APRTs indican que estas enzimas tienen también un papel importante en las respuestas a estrés en las plantas de judía.

Common bean (Phaseolus vulgaris L) is one of the most important crops, not only for its high nutritional value, but also for its environmental advantages. This is because, as a legume, common bean can fix atmospheric N (N2) in its root nodules, thus reducing the requirement of fertilizers and its consequent emission of greenhouse gases. However, N2 fixation is particularly sensitive to various adverse conditions such as drought, whose effects are being aggravated by climate change. For this reason, farmers opt for the use of fertilizers that ensure a good harvest. Therefore, studying the effects of drought on these legumes is of special relevance in arid regions such as Andalusia (Spain), where the availability of water is increasingly scarce, and drought is one of the factors that most limit crop productivity. This Thesis work is organized into 4 chapters in which the regulation at the molecular, biochemical, and physiological level of the response mechanisms of P. vulgaris plants against water stress is studied. Recently, transcriptomics has become a very useful tool for the evaluation of the environmental responses in different plant species. Therefore, in chapter 1 we analysed the transcriptomic changes (RNA-seq) in response to water stress in a P. vulgaris (PHA-0683) landrace resistant to drought. Leaves from control plants and plants subjected to 10 days of drought, cultivated under N2 fixation conditions, were used. The transcriptomic analysis showed the decrease in the expression of genes associated with the inhibition of the abscisic acid (ABA) response, the main stress response hormone in the plant. In addition, they were a significant number of differentially expressed genes (DEG) related to the response to phosphate (P) deficiency. Relevance of P acquisition under stress was confirmed by drought experiments performed with various concentrations of P, thus revealing that, among the tolerance mechanisms of this resistant landrace is the ability to mobilize phosphate under stress conditions. Domestication, global expansion, and local agricultural practices have involved the development of a wide variety of common bean lines or genotypes with varying degrees of resistance to water stress. Therefore, in chapter 2, the study of the molecular and physiological response to water stress of two common bean genotypes was carried out. For this, the P. vulgaris landrace (PHA-0683), previously described as having a high degree of tolerance to drought, and the market class breeding line Great Northern (PMB- 0220), with intermediate tolerance to drought, but higher productivity, were compared. The comparison showed that while the landrace PHA-068 kept its physiological parameters stable, the market class PMB-0220 decreased its leaf water content, its shoots biomass, and the chlorophyll content in its oldest leaf tissue. The analysis of expresión levels of relevant genes related to the ABA response and transcription factors that regulate senescence showed clear qualitative and quantitative differences in the expresión patterns in response to drought between the two genotypes. To increase tolerance to drought in more productive bean crops, in chapter 3 the response to water stress was analyzed in greater depth in plants of the commercial line PMB-0220, which despite being less tolerant to drought than PHA-0683, has higher productivity. Despite the advantages of growing legumes such as N2 fixation common beans, many farmers prefer the use of nitrogen fertilizers to ensure a good harvest. In this chapter, the response to drought was studied in PMB-0220 bean plants grown with inorganic nitrogen from fertilization, or under symbiosis and nitrogen fixation conditions. To do this, in this chapter we combined transcriptomic and metabolomic analysis, together with physiological analysis. Leaf tissue from plants subjected to 10 days of drought and fertilized with nitrate or in symbiosis with rhizobia was used in the -omic analyses. The study of differential gene expression showed that plants grown with N2 fixation had higher induction of genes associated with ABA synthesis and response to water stress, even in the absence of stress, compared to plants fertilized with NO3 -. Likewise, the induction of genes related to the metabolism of soluble sugars and with the maintenance of osmotic balance in N2-fixing plants subjected to drought was also observed. The metabolomic analysis confirmed that plants in symbiosis and subjected to 10 days of drought accumulated a higher concentration of drought response metabolites, such as the ABA hormone itself, ureides (allantoin), soluble sugars, and other metabolites that maintain the osmotic balance in the plant, as raffinose and proline, as well as various lipids that help maintain membrane fluidity. The physiological study confirmed that N2- fixing plants maintained their leaf water content better and were better adapted than plants fertilized with NO3 -. In this chapter, a recovery experiment was carried out after the wáter stress treatment, in which the plants were irrigated again after 10 days of drought and cultivated until the pod collection. The N2-fixing plants, after rehydration, recovered their gas exchange values, their photosynthesis rate and even maintained pod production, whereas the NO3 - fertilized plants did not manage to recover from the drought, they maintained reduced gas exchange and photosynthesis values despite rehydration and decreased their pod and seeds yields. Several studies have indicated the positive role of ureides in different stress situations. Purine nucleotides, precursors to ureides, can be synthesized by the de novo synthesis or obtained by salvage pathways of purine bases. Two enzymes are responsible for purine salvage, adenine phosphoribosyltransferase (APRT) which catalyzes the adenine salvage and hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) which catalyzes the salvage of guanine and hypoxanthine. In chapter 4, the molecular, biochemical, and functional characterization of the first of these two enzymes is addressed. Adenine phosphoribosyltransferase is encoded by four genes in P. vulgaris. Phylogenetic analysis, as well as the overexpression of the four coded proteins fused to -YFP (Yellow fluorescent protein) in Nicotiana benthamiana plants, revealed that the common vean APRTs were grouped into two "clusters", two of the four proteins have possible location to chloroplast, while the other two are in the cytosol. The biochemical characterization, gene expression pattern, and the levels of activity in the different tissues of P. vulgaris showed that PvAPRT1 and PvAPRT5 were the predominant proteins and that, interestingly, they had high levels of expression in roots and nodules. To elucidate the specific role played by these isoforms, roots mutated in each of the two genes were generated by gene editing using CRISPR/Cas9 technology. Finally, the physiological and metabolomic analysis of these transgenic roots revealed that, although the PvAPRT1 is mainly involved in the adenine salvage pathway, the PvAPRT5 could function in the regulation of cytokinin levels, modifying root growth and nodulation. In addition, both the transcriptomic data from the previous chapters, and the results of the metabolomic profiles of roots with mutations in the genes that encode APRTs, indicate that these enzymes also have an important role in stress responses in common bean plants.