Novel regulatory mechanisms of Kiss1 neurons during reproductive axis development and in conditions of metabolic stress: Analysis of the roles of microRNAs and elements of the secretory pathway

Abstract

Reproduction is indispensable for the perpetuation of the species. Therefore, it is safeguarded by a sophisticated network of regulatory mechanisms that ultimately controls the reproductive function by modulating the activity of the so-called hypothalamicpituitary- gonadal (HPG) axis1,2. The HPG axis is composed by: i) the hypothalamus, where a scattered and small population of neurons secreting the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) resides; ii) the anterior pituitary, where GnRH stimulates gonadotroph cells to secrete gonadotropin hormones, luteinizing hormone (LH) and folliclestimulating hormone (FSH); and iii) the gonads, testes in males and ovaries in females, where gonadotropins stimulate both gametogenesis and the secretion of peptide and steroid hormones. Importantly, GnRH neurons constitute the main hierarchical element where all regulatory signals ultimately converge for the brain control of reproduction1. In this context, the Kiss1/Gpr54 system, composed by kisspeptins and their receptor, Gpr54, has emerged as the most important upstream regulator of GnRH neurons, with an essential role for the acquisition (puberty) and the maintenance (fertility) of the reproductive function3. Thus, the roles of Kiss1 neurons, controlling both the surge and pulsatile modes of GnRH/gonadotropin secretion, have been well characterized4. Given their importance, substantial efforts have been made in the field to understand the regulatory mechanism controlling Kiss1 neurons3,5. However, considering that most on the attention has been focused on studying the transcriptional regulation of Kiss1 expression, our knowledge about other mechanisms potentially contributing to the regulation of Kiss1 neurons is still fragmentary and yet to be fully disclosed. In this context, microRNAs (miRNAs) are small RNA molecules that act as epigenetic regulators by post-transcriptionally repressing gene expression6. Albeit other epigenetic mechanisms regulating the Kiss1 gene, such as DNA methylation and histone modifications, have begun recently to be explored5,7, the role of miRNAs in the control of Kiss1 neurons has remain elusive until now. In the same vein, previous evidence in the literature evaluating changes in both Kiss1 mRNA and kisspeptin protein in response to certain experimental conditions hinted that these two parameters do not always change in the same manner8–10, suggesting the existence of an additional mechanism of regulation of Kiss1 neurons at the secretory level. However, despite its potential relevance, the functional characterization and the molecular basis of this regulatory mechanism controlling the secretory capacity of Kiss1 neurons had not been explored so far. On this basis, this Doctoral Thesis has explored: (i) the physiological role and molecular mechanisms of miRNAs in Kiss1 neurons for the control of reproductive function; and (ii) the main elements of the secretory pathway operating in Kiss1 neurons that participates in the adaptative responses to a condition of metabolic stress.

La reproduccion es una funcion indispensable para la perpetuacion de las especies. Por tanto, se encuentra bajo el control de una sofisticada red de mecanismos reguladores que en ultima instancia controlan su funcionamiento a traves de la modulacion de la actividad del llamado eje hipotalamo-hipofiso-gonadal (HHG)1,2. El eje HHG esta compuesto por: i) el hipotalamo, donde reside una pequena y dispersa poblacion de neuronas que secretan la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH); ii) la adenohipofisis, donde la GnRH estimula a las celulas gonadotropas para que secreten gonadotropinas, las cuales son la hormona luteinizante (LH) y la hormona foliculo-estimulante (FSH); y iii) las gonadas, testiculos en machos y ovarios en hembra, donde las gonadotropinas estimulan tanto la gametogenesis como la secrecion de hormonas de naturaleza peptidica y esteroidea. En este sentido, las neuronas GnRH constituyen un elemento jerarquico clave en el que convergen en ultima instancia todas las senales que participan en el control de la reproduccion a nivel central1. En este contexto, el sistema Kiss1/Gpr54, compuesto por las kisspeptinas y su receptor, Gpr54, ha sido reconocido en las ultimas decadas como uno de los reguladores mas importantes de las neuronas GnRH, teniendo un papel fundamental para la adquisicion (pubertad) y el mantenimiento (fertilidad) de la función reproductora3. De hecho, se ha caracterizado el importante papel de las neuronas Kiss1 en el control de la secrecion pulsatil y el pico preovulatorio de GnRH/gonadotropinas4. Dada su importancia, se han llevado a cabo esfuerzos sustanciales en el campo para comprender los mecanismos reguladores que controlan a las neuronas Kiss13,5. Sin embargo, dado que la mayoria de la atencion se ha centrado en el estudio de los mecanismos de regulacion transcripcional que controlan la expresion del gen Kiss1, nuestro conocimiento sobre otros mecanismos que puedan contribuir de forma potencial a la regulacion de las neuronas Kiss1 es aun limitado y necesita ser ampliado. En este contexto, los microRNAs (miRNAs) son pequenas moleculas de RNA que actúan como reguladores epigeneticos mediante la represion post-transcripcional de la expresión genica6. Aunque recientemente se han empezado a explorar otros mecanismos epigeneticos que regulan el gen Kiss1, como la metilacion del ADN y las modificaciones de histonas, el papel de los miRNAs5,7 en las neuronas Kiss1 no ha sido explorado hasta la fecha. En la misma linea, existen datos publicados en la literatura que evaluan cambios tanto en los niveles de mRNA de Kiss1 como de la proteina kisspeptina en respuesta a ciertas condiciones experimentales e indican que estos parametros no siempre cambian simultaneamente en la misma direccion8–10, sugiriendo la existencia de un mecanismo de regulacion adicional de las neuronas Kiss1 a nivel secretor. Sin embargo, pese a su potencial relevancia, aun no se han estudiado, hasta la fecha, las características funcionales ni las bases moleculares de este mecanismo de regulacion que controla la capacidad secretora de las neuronas Kiss1. En este contexto, esta tesis doctoral ha explorado: (i) el papel fisiologico y los mecanismos moleculares a traves de los cuales participan los miRNAs en las neuronas Kiss1 en el control de la funcion reproductora; y (ii) los principales mecanismos de regulacion de la secrecion que operan en neuronas Kiss1 y que participan en las respuestas adaptativas frente a una condicion de estres metabolico.