Bases de la respuesta a estrés salino en la levadura Debaryomyces hansenii

Abstract

Debaryomyces hansenii es una levadura osmo-, xero- y generalmente considerada halotolerante que, gracias a las múltiples adaptaciones que posee puede hacer frente a altas concentraciones de sal en el medio. Esta levadura ha sido utilizada como modelo en estudios de estrés salino centrados en los cationes potasio y sodio, por lo que, otros cationes alcalinos como el litio se encuentran poco estudiados. El efecto de la sal sobre el metabolismo de esta levadura se encuentra escasamente descrito y no ha sido posible obtener conclusiones claras sobre este tema debido a las numerosas contradicciones entre los diferentes autores, impidiendo así, obtener información sobre aspectos básicos del metabolismo como, por ejemplo, la capacidad fermentativa. En la presente tesis se han estudiado diferentes aspectos fisiológicos y metabólicos de D. hansenii en respuesta al estrés salino. En primer lugar, hemos determinado el efecto de diferentes cationes alcalinos sobre la fisiología de D. hansenii. Nuestros resultados muestran que una concentración media alta (0,5 M) de sodio o potasio favorece el crecimiento, sin embargo, concentraciones más altas de ambos cationes tienen efectos negativos sobre la levadura. Por otra parte, el litio es un elemento tóxico, sin embargo, esta toxicidad se ve mitigada en presencia de sodio o potasio, al menos en parte, debido a la inhibición del flujo del litio hacia el interior celular. Adicionalmente, se ha estudiado el efecto de los diferentes cationes sobre la homeostasis iónica y se ha podido comprobar que el litio se acumula en menor medida que el potasio o el sodio, indicando así, que este catión presenta una alta toxicidad incluso en pequeñas cantidades. Para finalizar esta primera parte, se han calculado los niveles de metabolitos como, por ejemplo, los fosfatos o las Especies Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico (TBARS). Los análisis realizados muestran que una concentración media-alta de sodio (0,5 M) provoca un aumento de los niveles tanto de fosfatos como de Especies Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico (TBARS), por el contrario, el litio causa una disminución de la concentración de ambos metabolitos independientemente de la cantidad de litio utilizada Posteriormente, se ha querido obtener información sobre aspectos básicos del metabolismo de D. hansenii como, por ejemplo, la capacidad fermentativa. Los resultados muestran que la cepa CBS767 de D. hansenii carece de una capacidad fermentativa mínima ya que no produce etanol ni en condiciones de salinidad inducida por sodio o litio ni en ausencia de sales en el medio. Por último, se ha determinado el efecto del sodio y el litio sobre diferentes rutas metabólicas. En esta parte de la tesis se han realizado aproximaciones a distintos niveles desde uno más centrado en los metabolitos hasta un nivel más transcripcional. Nuestros resultados muestran que el sodio inhibe algunas enzimas relacionadas con las primeras etapas de la glucólisis, mientras que, una concentración baja de litio estimula dichas enzimas. Los diferentes análisis realizados con relación al ciclo del ácido glioxílico muestran que el sodio estimula dicha ruta metabólica. Esta estimulación se puede observar en todos los niveles estudiados, observándose, un incremento en los niveles de metabolitos relacionados con dicho ciclo metabólico, como son el glioxilato o el malato, así como en la actividad de enzimas relacionadas, como son la isocitrato liasa y la malato sintasa. Adicionalmente, los niveles de transcripción de los genes que codifican dichas enzimas aumentan en presencia de sodio. Por el contrario, el litio inhibe esta ruta metabólica, a favor del ciclo de Krebs. Esta inhibición se ve reflejada en una disminución tanto a nivel de metabolitos como a nivel enzimático-transcripcional. Por otra parte, la estimulación del ciclo de Krebs se puede observar mediante el aumento en la concentración de metabolitos relacionados con dicha ruta metabólica como el oxoglurato y en la actividad de la isocitrato deshidrogenasa.

Debaryomyces hansenii is an osmo-, xero- and generally considered halotolerant yeast which, thanks to its adaptations, can cope with high salts concentrations in the medium. This yeast has been used as a model in salt stress studies focused on potassium and sodium cation, so that, other alkali cations, such as lithium, are poorly studied. The effect of salt on the metabolism of this yeast is sparsely described and it hasn’t been posible to obtain clear conclusions about this topic due to the numerous contradictions between the different authors, preventing from obtaining information about basic aspects of the metabolism, for example, the fermentative capacity. In this thesis, different physiologic and metabolic aspects of D. hansenii in response to salt stress have been studied. Firstly, we have determined the effect of different alkali cations on the physiology of D. hansenii. Our results show that a medium-high concentration (0.5 M) of sodium or potassium promotes yeast growth, but higher concentrations of both cations have negative effect on the yeast. On the other hand, lithium is a toxic element, however, this toxicity is partially mitigated by the presence of sodium or potassium in the medium, partly, due to the inhibition of the flow into the cellular interior. Additionally, the effect of the different cations on ionic homeostasis has been studied, and it has been posible to check that lithium accumulates to a less extent than sodium or potassium, indicating that, this cation has a high toxicity even in small quantities. To conclude this first part, the levels of some metabolites, such as, phosphates or Thiobarbituric Reactives Substances (TBARs) have been measured. Analysis carried out show that a medium-high concentration (0.5 M) of sodium increases the levels of phosphates and TBAç´´Rs, by contrast, lithium causes a decrease in the concentration of both metabolites, independently of the concentration used. Subsequently, the aim has been to obtain information about basic aspects of the metabolism, such as, the fermentative capacity. Results show that the CBS767 strain of Debaryomyces hansenii lacks a fermentative capacity since it doesn’t produce etanol neither in salt conditions nor in absence of salt. Last, we have determined the effect of sodium and lithium on different metabolic pathways. In this part of the thesis, we have done approaches at different levels, from one more focused on metabolites to another more transcriptionally focused. Our results show that sodium inhibits some enzymes related to the first stages of the glycolysis, while a low concentration of lithium (0.1 M) stimulates those enzymes. The análisis related to Glyoxylic Acid Cycle show that sodium stimulates this metabolic pathway. This stimulation can be seen at all studied levels, observing, an increase in the level of metabolites related to this metabolic cycle, such as, Glyoxylate or Malate, so that in enzymes related like Isocitrate lyase or Malate synthase. Additionally, the transcription levels of genes which code for these enzymes are increased by the presence of sodium. By contrast, lithium inhibits this metabolic pathway, in favour to Krebs Cycle. This inhibition can be seen in a decrease not only at the metabolites level but also at enzymatic-transcriptional level. On the other hand, the stimulation of the Krebs Cycle can be seen by the increase of the concentration of metabolites related, such as, oxoglutarate and in the activity of Isocitrate dehydrogenase.