Pea genetic breeding to enhance rust resistance in Mediterranean environments

Abstract

Rust diseases are a significant concern in legume production worldwide, causing substantial losses, particularly in developing countries that rely on grain legumes as a staple food and a key protein source. Fungal species from the genera Uromyces, Phakopsora, and Puccinia are the main causative agents. They contribute to yield losses of up to 100% in susceptible cultivars and are emerging as a substantial threat to global food security. Therefore, developing durable resistance to rusts has become a critical goal in plant breeding, along with efforts to improve cultural practices and disease management. This doctoral thesis begins by specifically focusing on recent advances in understanding and improving genetic resistance to rust in various leguminous crops, as they share common infection and resistance strategies that are approachable from a plant breeding perspective. Key topics covered in the first chapter include: i) the diversity and host range of rust species affecting legumes; ii) disease management strategies ranging from cultural practices to chemical control; iii) available detection methods to identify new sources of resistance; iv) the genetic basis of resistance, encompassing both major resistance genes and quantitative trait loci; v) insights into genetic regulation and effector molecules that lead to interactions between legumes and rust; and vi) emerging genomics-assisted breeding techniques that can accelerate the development of durable resistance to rust in legumes. Overall, the first chapter of this doctoral thesis highlights the progress made to date and the remaining challenges in the sustainable management of rusts in various leguminous crops through integrated approaches that encompass pathogen biology, advanced phenotyping, genetic resistance, and molecular breeding.

Pea (Pisum sativum L.) is a temperate zone grain legume that is extensively cultivated. It ranks as the second most cultivated legume in the world and the first in Europe, including both dry and green peas. Its use extends to food and feed and represents a versatile and economical protein source, offering benefits to human health. Pea rust has become a major concern globally, causing losses between 30-50% under suitable climatic conditions for the fungus. Depending on the region, pea rust has been reported to be caused by Uromyces viciae-fabae (Pers. de Bary) in tropical and subtropical zones, or by U. pisi (Pers.) (Wint.) in more temperate areas. To date, only moderate levels of partial resistance against U. pisi have been identified in peas, urging an expansion of available resistance levels for breeding. In the second chapter of this doctoral thesis, we describe the response to U. pisi in 320 Pisum spp. accessions, including cultivated peas and wild relatives, under both field and controlled conditions. Significant variations in the response to U. pisi infection were observed for most traits among the pea samples, in both field and controlled conditions, allowing for the detection of genotypes with partial resistance. Simultaneous multi-trait indices were applied to the datasets, enabling the identification of partial resistance, particularly in the samples JI224, BGE004710, JI198, JI199, CGN10205, and CGN10206. Macroscopic observations were complemented by histological observations of the nine most resistant accessions and compared to three intermediate and three susceptible ones. This study confirmed that the reduction in infection of the resistant accessions was associated with smaller rust colonies due to a decrease in the number of haustoria and hyphal tips per colony. Furthermore, a late-acting hypersensitive response was identified for the first time in a pea sample (PI273209). The findings obtained in the second chapter demonstrate that screening pea collections remains a necessary method in the search for complete resistance against U. pisi. Additionally, the wide phenotypic diversity contained in the studied collection will be useful for further association analysis and breeding perspectives.

Therefore, rust is a harmful disease that affects vital crops, including peas, and the identification of highly resistant genotypes remains a challenge, as concluded in the second chapter. Accurate measurement of infection levels in large germplasm collections is crucial for finding new sources of resistance. Current evaluation methods are based on the visual estimation of disease severity and infection type under field or controlled conditions. While they identify some sources of resistance, they are prone to errors and time-consuming. An image analysis system proves useful, as it provides an affordable and user-friendly way to quickly count and measure rust-induced pustules in pea samples. In the third chapter of this doctoral thesis, an automated image analysis process was developed to accurately calculate the parameters of rust disease progression under controlled conditions, ensuring reliable data collection. This work was carried out using R to create a highly efficient and automated image-based method for evaluating rust on pea leaves. The optimization and validation of the method involved testing different segmentation indices and image resolutions on 600 pea leaflets with rust symptoms. The approach allows for the automatic estimation of parameters such as the number of pustules, the size of the pustules, leaf area, and the percentage of pustule coverage. It reconstructs timeseries data for each leaf and integrates daily estimates into the disease progression parameters, including the latency period and the area under the disease progression curve. In this chapter, significant variation in disease responses among genotypes was observed using visual ratings and image-based analysis. Among the evaluated segmentation indices, the Normalized Green-Red Difference Index (NGRDI) proved to be the fastest, analysing 600 leaflets with 60% resolution in 62 seconds using parallel processing. The Lin's Concordance Correlation Coefficient between visual and image-based pustule counts showed an accuracy greater than 0.98 at full resolution. While a lower resolution slightly reduced accuracy, the differences were statistically insignificant for most disease progression parameters, significantly reducing processing time and storage space. NGRDI was optimal at all times, providing highly accurate estimates with minimal cumulative error. This work proposes a new image-based method to monitor pea rust disease on detached leaves, using RGB spectral index segmentation and pixel value thresholding, to improve resolution and accuracy compared to traditional evaluations. This allows for the rapid analysis of hundreds of images with accuracy comparable to visual methods and superior to other image-based approaches. This method evaluates the progression of rust in peas, eliminating evaluator-induced errors in traditional methods. Implementing this new approach to evaluate large germplasm collections will enhance our understanding of plant-pathogen interactions and aid in the future breeding of new pea cultivars with greater resistance to rust.

In the fourth chapter, it is highlighted that, despite some efforts to assess the natural variation in pea resistance, its efficient exploitation in plant breeding is limited due to the scarcity of identified resistance loci and the unknown nature of their responsible genes. To overcome this knowledge gap, a comprehensive genomewide association study (GWAS) on pea rust, caused by Uromyces pisi, was conducted to discover genetic loci associated with resistance. This utilized the datasets produced in the previous two chapters. Thus, using a diverse collection of 320 pea accessions and the phenotypic responses to two rust isolates using traditional methods and advanced image-based phenotyping, the association studies were carried out. We detected 95 significant trait marker associations using a set of 26,045 polymorphic DArT-seq markers. Our in-silico analysis identified 62 candidate genes supposedly involved in rust resistance, grouped into different functional categories, such as gene expression regulation, vesicle trafficking, cell wall biosynthesis, and hormonal signalling. This research conducted in the fifth chapter highlights the potential of GWAS to identify sources of resistance, molecular markers associated with resistance, and candidate genes against pea rust, offering new targets for precisión breeding. By integrating our findings with current breeding programs, we can facilitate the development of pea varieties with greater rust resistance, contributing to sustainable agricultural practices and food security. This study lays the groundwork for future functional genomic analyses and the application of genomic selection approaches to improve disease resistance in peas.

In the fifth and final chapter, the same phenotypic and genotypic datasets were used for a marker-assisted selection (MAS) approach different from GWAS: Genomic Selection (GS). Genomic prediction or selection has become an indispensable tool in modern plant breeding, particularly for complex traits such as resistance to rust in peas, which are strongly influenced by environmental factors. In this chapter, the effectiveness of GS to predict rust resistance was evaluated, using the panel of 320 pea accessions and 26,045 Silico-DArT markers. We compared the predictive abilities of various GS models, including the Best Linear Unbiased Genomic Prediction (GBLUP), and explored the impact of incorporating marker × environment (MxE) interactions as a covariate in the GBLUP model. The analysis encompassed both data generated in the field and under controlled conditions. We assessed the predictive accuracy of different cross-validation strategies and compared the efficiency of using single traits versus a multi-trait index approach, specifically FAI-BLUP, which combines traits from controlled conditions. The GBLUP model, particularly when modified to include MxE interactions, consistently outperformed other models, demonstrating its suitability for traits affected by complex genotype-environment interactions. Specifically, the best predictive ability (0.635) was achieved using the FAI-BLUP approach within the Bayesian Lasso (BL) model. The inclusion of MxE interactions significantly improved prediction accuracy in various environments in the GBLUP models, although it did not notably improve predictions for nonphenotyped lines. These findings highlight the variability of predictive capabilities due to genotype by environment interactions (GEI) and the effectiveness of multitrait approaches in addressing such complexities. Overall, our study illustrates the potential of GS, especially when employing a multi-trait index like FAI-BLUP and considering MxE interactions, in pea breeding programs focused on rust resistance. This approach provides a solid framework to tackle the challenges of GEI, making GS an asset in the quest for improved rust resistance in peas.

Las royas son una preocupación importante en la producción de leguminosas en todo el mundo y causan pérdidas sustanciales, particularmente en los países en desarrollo que dependen de las leguminosas como alimento básico y fuente clave de proteínas. Las especies de hongos de los géneros Uromyces, Phakopsora y Puccinia son los principales agentes causantes. Contribuyen a pérdidas de rendimiento de hasta el 100% en cultivares susceptibles y están surgiendo como una amenaza sustancial para la seguridad alimentaria mundial. Por lo tanto, desarrollar una resistencia duradera a las royas se ha convertido en un objetivo crítico en el fitomejoramiento, junto con los esfuerzos para mejorar las prácticas culturales y el manejo de enfermedades. Esta tesis doctoral comienza centrándose específicamente en los avances recientes en la comprensión y mejora de la resistencia genética a la roya en varios cultivos de leguminosas, ya que comparten estrategias comunes de infección y resistencia que son accesibles desde una perspectiva de fitomejoramiento. Los temas clave cubiertos en el primer capítulo incluyen: i) la diversidad y la gama de huéspedes de especies de roya que afectan a las leguminosas; ii) estrategias de manejo de enfermedades que van desde prácticas culturales hasta control químico; iii) métodos de detección disponibles para identificar nuevas fuentes de resistencia; iv) la base genética de la resistencia, que abarca tanto los principales genes de resistencia como los loci de rasgos cuantitativos (QTL); v) conocimientos sobre la regulación genética y las moléculas efectoras que conducen a interacciones entre las leguminosas y la roya; y vi) nuevas técnicas de mejoramiento asistidas por genómica que pueden acelerar el desarrollo de una resistencia duradera a la roya en las leguminosas. En general, el primer capítulo de esta tesis doctoral destaca los avances realizados hasta la fecha y los desafíos pendientes en el manejo sostenible de las royas en diversos cultivos de leguminosas a través de enfoques integrados que abarcan la biología de patógenos, el fenotipado avanzado, la resistencia genética y el mejoramiento molecular.

El guisante (Pisum sativum L.) es una leguminosa de grano de zona templada que se cultiva extensivamente. Se sitúa como la segunda leguminosa más cultivada en el mundo y la primera en Europa, incluyendo tanto los guisantes secos como los verdes. Su uso se extiende a los alimentos y piensos y representa una fuente de proteínas versátil y económica, que ofrece beneficios para la salud humana. La roya del guisante se ha convertido en una gran preocupación a nivel mundial, provocando pérdidas de entre el 30 y el 50 % en condiciones climáticas adecuadas para el hongo. Dependiendo de la región, se ha informado que la roya del guisante es causada por Uromyces viciae-fabae (Pers. de Bary) en zonas tropicales y subtropicales, o por U. pisi (Pers.) (Wint.) en áreas más templadas. Hasta la fecha, sólo se han identificado niveles moderados de resistencia parcial contra U. pisi en los guisantes, lo que insta a ampliar los niveles de resistencia disponibles para el mejoramiento. En el segundo capítulo de esta tesis doctoral describimos la respuesta a U. pisi en 320 Pisum spp. accesiones, incluidos guisantes cultivados y parientes silvestres, tanto en condiciones de campo como controladas. Se observaron variaciones significativas en la respuesta a la infección por U. pisi para la mayoría de los rasgos entre las muestras de guisantes, tanto en condiciones de campo como controladas, lo que permitió la detección de genotipos con resistencia parcial. Se aplicaron índices de multi-rasgos simultáneos a los conjuntos de datos, lo que permitió la identificación de resistencia parcial, particularmente en las entradas JI224, BGE004710, JI198, JI199, CGN10205 y CGN10206. Las observaciones macroscópicas se complementaron con observaciones histológicas de las nueve accesiones más resistentes y se compararon con tres intermedias y tres susceptibles. Este estudio confirmó que la reducción en la infección de las accesiones resistentes se asoció con colonias de roya más pequeñas debido a una disminución en el número de haustorios y puntas de hifas por colonia. Además, se identificó por primera vez una respuesta hipersensible de acción tardía en una muestra de guisantes (PI273209). Los hallazgos obtenidos en el segundo capítulo demuestran que el cribado de colecciones de guisantes sigue siendo un método necesario en la búsqueda de una resistencia completa contra U. pisi. Además, la amplia diversidad fenotípica contenida en la colección estudiada será útil para análisis de asociación adicionales y perspectivas de mejoramiento.

Así pues, la roya es una enfermedad dañina que afecta a cultivos vitales, incluidos los guisantes, y la identificación de genotipos altamente resistentes sigue siendo un desafío, como se concluye en el segundo capítulo. La medición precisa de los niveles de infección en grandes colecciones de germoplasma es crucial para encontrar nuevas fuentes de resistencia. Los métodos de evaluación actuales se basan en la estimación visual de la gravedad de la enfermedad y el tipo de infección en condiciones de campo o controladas. Si bien identifican algunas fuentes de resistencia, son propensos a cometer errores y requieren mucho tiempo. Un sistema de análisis de imágenes resulta útil, ya que proporciona una forma asequible y fácil de usar para contar y medir rápidamente las pústulas inducidas por la roya en accesiones de guisantes. En el tercer capítulo de esta tesis doctoral, se desarrolló un proceso automatizado de análisis de imágenes para calcular con precisión los parámetros de la progresión de la roya en condiciones controladas, garantizando una recopilación de datos confiable. Este trabajo se llevó a cabo utilizando R para crear un método basado en imágenes altamente eficiente y automatizado para evaluar la roya en las hojas de guisantes. La optimización y validación del método implicó probar diferentes índices de segmentación y resoluciones de imagen en 600 folíolos de guisantes con síntomas de roya. Este método permite la estimación automática de parámetros como el número de pústulas, el tamaño de las pústulas, el área foliar y el porcentaje de cobertura de las pústulas. Es capaz de reconstruir datos de series temporales para cada hoja e integra estimaciones diarias en los parámetros de progresión de la enfermedad, incluido el período de latencia y el área bajo la curva de progresión de la enfermedad. En este capítulo, se observó una variación significativa en las respuestas a las enfermedades entre genotipos mediante clasificaciones visuales y análisis basados en imágenes. Entre los índices de segmentación evaluados, el Índice Normalizado de Diferencia Verde-Rojo (NGRDI) demostró ser el más rápido, analizando 600 muestras con una resolución del 60% en 62 segundos utilizando procesamiento paralelo de la GPU. El coeficiente de correlación deconcordancia de Lin entre los recuentos de pústulas visuales y basados en imágenes mostró una precisión superior a 0,98 a resolución completa. Si bien una resolución más baja redujo ligeramente la precisión, las diferencias fueron estadísticamente insignificantes para la mayoría de los parámetros de progresión de la enfermedad, lo que redujo significativamente el tiempo de procesamiento y el espacio de almacenamiento. NGRDI fue el índice de segmentación óptimo en todo momento, proporcionando estimaciones muy precisas con un error acumulativo mínimo. Este trabajo propone un nuevo método basado en imágenes para monitorear la enfermedad de la roya del guisante en foliolos, utilizando segmentación del índice espectral RGB y categorización del valor de píxeles, para mejorar la resolución y precisión en comparación con las evaluaciones tradicionales. Esto permite el análisis rápido de cientos de imágenes con una precisión comparable a la de los métodos visuales y superior a otros enfoques basados en imágenes. Este método evalúa la progresión de la roya en los guisantes, eliminando errores inducidos por el evaluador en los métodos tradicionales. La implementación de este nuevo enfoque para evaluar grandes colecciones de germoplasma mejorará nuestra comprensión de las interacciones entre plantas y patógenos y ayudará en el futuro mejoramiento de nuevos cultivares de guisantes con mayor resistencia a la roya.

En el cuarto capítulo se destaca que, a pesar de algunos esfuerzos para evaluar la variación natural en la resistencia de los guisantes, su explotación eficiente en el fitomejoramiento es limitada debido a la escasez de loci de resistencia identificados y la naturaleza desconocida de sus genes responsables. Para superar esta brecha de conocimiento, se llevó a cabo un estudio integral de asociación de todo el genoma (GWAS) sobre la roya del guisante, causada por Uromyces pisi, para descubrir loci genéticos asociados con la resistencia. Para ello se utilizaron los conjuntos de datos producidos en los dos capítulos anteriores. Así, utilizando una colección diversa de 320 accesiones de guisantes y las respuestas fenotípicas a dos aislados de roya utilizando métodos tradicionales y fenotipado avanzado basado en imágenes, se llevaron a cabo los estudios de asociación. Detectamos 95 asociaciones significativas de marcadores moleculares con los caracteres evaluados utilizando un conjunto de 26.045 marcadores polimórficos Silico-DArT. Nuestro análisis in-silico identificó 62 genes candidatos supuestamente involucrados en la resistencia a la roya, agrupados en diferentes categorías funcionales, como regulación de la expresión génica, tráfico de vesículas, biosíntesis de la pared celular y señalización hormonal. Esta investigación realizada en el quinto capítulo destaca el potencial de GWAS para identificar fuentes de resistencia, marcadores moleculares asociados con la resistencia y genes candidatos contra la roya del guisante, ofreciendo nuevos objetivos para el mejoramiento genético de precisión. Al integrar nuestros hallazgos con los programas de mejoramiento actuales, podemos facilitar el desarrollo de variedades de guisantes con mayor resistencia a la roya, contribuyendo a prácticas agrícolas sostenibles y a la seguridad alimentaria. Por lo tanto, este estudio sienta las bases para futuros análisis genómicos funcionales y la aplicación de enfoques de selección genómica para mejorar la resistencia a enfermedades en los guisantes.

En el quinto y último capítulo, se utilizaron los mismos conjuntos de datos fenotípicos y genotípicos para un enfoque de selección asistida por marcadores (MAS) diferente de GWAS: selección genómica (GS). La predicción o selección genómica se ha convertido en una herramienta indispensable en el fitomejoramiento moderno, particularmente para rasgos complejos como la resistencia a la roya en los guisantes, que están fuertemente influenciados por factores ambientales. En este capítulo se evaluó la efectividad de GS para predecir la resistencia a la roya, utilizando el panel de 320 accesiones de guisantes y 26,045 marcadores Silico-DArT. Comparamos las capacidades predictivas de varios modelos GS, incluida la Mejor Predicción Genómica Lineal Imparcial (GBLUP), y exploramos el impacto de incorporar interacciones marcador × ambiente (MxE) como covariable en el modelo GBLUP. El análisis abarcó tanto los datos generados en campo como en condiciones controladas. Evaluamos la capacidad predictiva de diferentes estrategias de validación cruzada y comparamos la eficiencia del uso de rasgos únicos versus un enfoque de índice de multi-rasgo, específicamente FAI-BLUP, que combina rasgos evaluados en condiciones controladas. El modelo GBLUP, particularmente cuando se modificó para incluir interacciones MxE, superó consistentemente a otros modelos, lo que demuestra su idoneidad para rasgos afectados por interacciones complejas genotipo-ambiente. Específicamente, la mejor capacidad predictiva (0,635) se logró utilizando el enfoque FAI-BLUP dentro del modelo Bayesiano Lasso (BL). La inclusión de interacciones MxE mejoró significativamente la precisión de la predicción en diversos entornos en los modelos GBLUP, aunque no mejoró notablemente las predicciones para líneas no fenotipadas en ambientes conocidos. Estos hallazgos resaltan la variabilidad de las capacidades predictivas debido a las interacciones entre el genotipo y el entorno (GEI) y la eficacia de los enfoques de multi-rasgo para abordar tales complejidades. En general, en este capítulo se ilustra el potencial de GS, especialmente cuando se emplea un índice como FAI-BLUP y se consideran las interacciones MxE, en programas de mejoramiento de guisantes enfocados en la resistencia a la roya. Este enfoque proporciona un marco sólido para abordar los desafíos de GEI, lo que convierte a GS en una herramienta aplicable en la búsqueda de una mejor resistencia a la roya en los guisantes.