The somatostatin/cortistatin/neuronostatin system and RNA-exosome complex as novel sources for the identification of useful diagnostic, prognostic and therapeutic tools in prostate cancer

Abstract

El cáncer de próstata (CaP) es una de las patologías tumorales más relevantes para el sistema sanitario, ya que cada año se registran 1.3 millones de nuevos casos y 400,000 muertes asociadas en todo el mundo. Los abordajes clínicos actuales de esta patología son similares en todo el mundo. En concreto, el tacto rectal (DRE), los niveles del antígeno prostático específico (PSA), y una biopsia con aguja gruesa son necesarios para diagnosticar un CaP. Sin embargo, diferentes técnicas basadas en la imagen [por ejemplo, la resonancia magnética (MRI), la tomografía por emisión de positrones (PET), la tomografía computarizada (CT), etc.] acompañan el proceso para clasificar y seleccionar el tratamiento más preciso para esta enfermedad. El tratamiento del CaP abarca desde la vigilancia activa y la cirugía (para estadios tempranos) hasta el uso de radioterapia, quimioterapia u hormonoterapia (para estadios tardíos), siendo este último enfoque el tratamiento más beneficioso del CaP avanzado debido a su progresión andrógenodependiente. Lamentablemente, entre el 10 y el 20 % de los pacientes desarrollan resistencia a la terapia hormonal, lo que conduce al fenotipo más agresivo, el CaP resistente a la castración (CPRC), que sigue siendo letal en la actualidad. Se están evaluando nuevos enfoques diagnósticos, pronósticos y terapéuticos para intentar mejorar el manejo clínico de esta patología. Sin embargo, el CaP sigue siendo una patología muy grave y se espera que el número de muertes asociadas al CaP se duplique para 2040, por lo que se necesita urgentemente un mayor conocimiento molecular sobre esta patología. En este sentido, el CaP ha sido bien caracterizado principalmente desde el punto de vista genómico. En concreto, los reordenamientos genómicos estructurales a gran escala y las alteraciones del número de copias en diferentes genes relacionados con el control del crecimiento, la estabilidad genética, la señalización androgénica o la respuesta al daño del ADN contribuyen al desarrollo, la progresión y la resistencia farmacológica del CaP. De manera más reciente, diferentes estudios indican que otros sistemas hormonales, además del sistema androgénico, así como las maquinarias celulares implicadas en el control del metabolismo del ARN, están profundamente alterados en el CaP, donde parecen tener un papel fisiopatológico crítico. Sin embargo, el sistema somatostatina (SST)/cortistatina (CORT)/neuronostatina (NST) [un sistema hormonal compuesto por tres ligandos peptídicos naturales (SST, CORT y NST) y diferentes receptores acoplados a proteínas G (SST1-5, GPR107, SST5TMD4/5)] y el Complejo ARN-Exosoma (REC; maquinaria celular estructuralmente compuesta por un núcleo, nucleasas y cofactores que interviene en el procesamiento y degradación 3'-5' de la mayoría de los tipos de ARN) han sido poco explorados en esta patología. En consecuencia, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue determinar la desregulación, el papel fisiopatológico y la implicación clínica del sistema SST/CORT/NST (péptidos naturales, receptores y análogos químicos; los resultados se incluyen en el primer apartado) y del REC (nucleasas, cofactores y elementos centrales; los resultados se incluyen en el segundo apartado) en el CaP, con el objetivo último de descubrir nuevos biomarcadores y herramientas terapéuticas para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y el manejo de los pacientes con CaP. Los resultados derivados del primer estudio mostraron que el tratamiento con SST y CORT inhibió parámetros funcionales de agresividad clave en células de CaP andrógeno independiente (AI). Mecanísticamente, la capacidad antitumoral de SST/CORT se asoció con la modulación de rutas de señalización oncogénica (p-AKT y p-JNK), y con la reducción significativa de la expresión de genes críticos implicados en la proliferación/migración y agresividad del CaP (e.g., MKI67, MMP9, EGF). Curiosamente, la CORT se expresaba en altos niveles, mientras que la SST no se detectó en todas las líneas celulares de próstata analizadas, lo que sugería que la CORT podría presentar una funciónautocrina/paracrina en células de CaP. En consonancia con esto, la CORT endógena se encontró sobreexpresada en muestras de CaP (en comparación con la hiperplasia prostática benigna) y correlacionada con parámetros clínicos (i.e., metástasis) y moleculares (i.e., expresión de SST2/SST5) clave. Finalmente, el silenciamiento de CORT aumentó drásticamente la tasa de proliferación y redujo la actividad antitumoral de los análogos de la SST (octreotido/pasireotido) en las células de CaP AI. Por otra parte, observamos que el receptor GPR107 se sobreexpresaba en CaP y se asociaba con parámetros clínicos relevantes (por ejemplo, estadio avanzado del CaP, presencia de invasión vascular y metástasis). Además, el silenciamiento de GPR107 inhibió las tasas de proliferación/migración en células de CaP AI y alteró la expresión de genes clave en la patofisiología del CaP (KI67, CDKN2D, MMP9, PRPF40A, SST5TMD4, AR-v7, In1-ghrelin, EZH2) y la actividad de vías de señalización oncogénicas del CaP (p-AKT). Curiosamente, el tratamiento con NST también inhibió la proliferación/migración sólo en células AI y evocó una respuesta molecular idéntica al silenciamiento de GPR107. Por último, NST redujo la expresión de GPR107 exclusivamente en células de CaP AI, lo que sugiere que parte de los efectos antitumorales específicos de NST podrían estar mediados por una regulación a la baja de GPR107. En conjunto, los resultados descritos anteriormente (aceptados en 2 publicaciones científicas) proporcionan evidencias sólidas demonstrando que el sistema SST/CORT/NST y los análogos de SST podrían representar una potencial opción terapéutica para el CaP, especialmente para el CPRC. Los resultados derivados de la segunda sección de esta Tesis Doctoral mostraron una desregulación específica de varios componentes del REC en tejidos de CaP en comparación de muestras control, identificando el factor Poly(A)-Binding-Protein-Nuclear 1 (PABPN1) como un regulador crítico de aspectos muy relevantes del CaP. Específicamente, PABPN1 se sobreexpresa consistentemente (a nivel de ARNm y proteína) en diferentes cohortes humanas de CaP y se asocia a una peor progresión, invasión y metástasis. Además, el silenciamiento de PABPN1 disminuyó características tumorales clave (proliferación, migración, tumoresferas, colonias, etc.) en diferentes modelos de CaP a través de la modulación de ARNs no codificantes largos (lncRNAs: PCA3, FALEC, DLEU2) y mRNAs (CDK2, CDK6, CDKN1A) claves relacionados con la agresividad tumoral. Además, los niveles plasmáticos de PABPN1 estaban alterados en pacientes con metástasis y recaída tumoral, lo que también muestra un potencial valor pronóstico para el CaP. Por último, la inhibición farmacológica de la actividad REC mediante el fármaco isoginkgetina inhibió drásticamente la agresividad de las células del CaP, lo que sugiere una potencial utilidad terapéutica para el tratamiento de esta patología. El conjunto de toda esta información revela que el REC está drásticamente desregulado en CaP, y que este nuevo mecanismo molecular, especialmente la alteración de PABPN1, podría ser potencialmente explotado como una nueva herramienta pronóstica y terapéutica para el CaP. En conjunto, los resultados globales obtenidos en esta Tesis Doctoral demuestran que componentes clave pertenecientes al sistema SST/CORT/NST y el REC están profundamente desregulados en el CaP, donde juegan un papel patofisiológico crucial en el desarrollo y progresión de esta enfermedad. Por lo tanto, la información aquí expuesta ofrece una mejor comprensión de la biología celular y molecular del CaP, y señala a estos sistemas reguladores como fuentes potenciales de nuevas herramientas diagnósticas, pronósticas y terapéuticas para el manejo de esta devastadora patología.

Prostate cancer (PCa) is one of the most relevant tumoral pathologies for the health system since 1.3 million new cases and 400,000 associated deaths are registered globally every year. The current clinical approaches for this pathology are similar worldwide. Specifically, the digital rectal exam (DRE), the levels of the prostatic-specific antigen (PSA), and a core-needle biopsy are necessary to diagnose PCa. However, different image-based techniques [e.g., Magnetic Resonance Imagin (MRI), Positron Emission Tomography (PET), computed tomography (CT) scan, etc.] accompany this diagnostic process in order to classify and select the most accurate treatment for this disease. PCa treatment ranges from active surveillance and surgery (for early stages) to the use of radiation, chemotherapy or hormone therapy (for late stages), being the latter approach the most beneficial treatment of advanced PCa due to its androgen-dependent progression. Unfortunately, between 10-20 % of the patients develop resistance to hormone therapy leading to the most aggressive phenotype, the castration-resistant PCa (CRPC), which remains lethal nowadays. Novel diagnostic, prognostic, and therapeutic approaches are being evaluated to improve the clinical management of this pathology. However, PCa is still a challenging pathology, expecting the double of PCa-associated deaths by 2040; therefore, further molecular knowledge about this pathology is urgently needed. In this sense, PCa has been well-characterized mainly from a genomic point of view. Specifically, large-scale structural genomic rearrangements and copy number alterations in different genes related to growth control, genetic stability, androgen-signalling or DNA damage response contribute to the development, progression and drug resistance of PCa. Most recently, different studies indicate that other hormonal systems, apart from the androgen system, as well as cellular machineries involved in the control of RNA-metabolism are profoundly altered in PCa, wherein they might have a critical pathophysiological role. However, the somatostatin (SST)/cortistatin (CORT)/neuronostatin (NST) system [a hormonal system composed of three natural peptide ligands (SST, CORT and NST) and different G-protein coupled receptor (SST1-5, GPR107, SST5TMD4/5)] and the RNA-Exosome Complex (REC; cellular machinery structurally comprised by a core, nucleases and cofactors which is involved in the 3´-5´processing and degradation for most types of RNAs) have been poorly explored in this pathology. Consequently, the general aim of this Doctoral Thesis was to determine the dysregulation, pathophysiological role and clinical implication of the SST/CORT/NST (natural peptides, receptors and chemical analogues; results included in the first section) system and of the REC (nucleases, co-factors and core elements; results included in the second section) in PCa, with the ultimate goal of discovering novel biomarkers and therapeutic tools to improve the diagnosis, treatment and management of PCa patients. The results of the first section showed that SST and CORT treatment inhibited key functional/aggressiveness parameters in Androgen-independent (AI) PCa cells. Mechanistically, the antitumor capacity of SST/CORT was associated with the modulation of oncogenic signalling pathways (p-AKT and p-JNK), and with a significant down-regulation of critical genes involved in proliferation/migration and PCa-aggressiveness (e.g., MKI67, MMP9, EGF). Interestingly, CORT was highly expressed, while SST was not detected, in all prostate cell models analysed, suggesting that CORT could exert an autocrine/paracrine function in PCa cells. In line with this, endogenous CORT was overexpressed in PCa samples (compared with benign prostatic hyperplasia) and correlated with key clinical (i.e., metastasis) and molecular (i.e., SST2/SST5 expression) parameters. Remarkably, CORTsilencing drastically enhanced the proliferation rate and blunted the antitumor activity of SST-analogues (octreotide/pasireotide) in AI-PCa cells. Additionally, we also found that GPR107 was overexpressed in PCa and associated with key clinical parameters (e.g., advanced stage of PCa, presence of vascular invasion and metastasis). Furthermore, GPR107-silencing inhibited proliferation/migration rates in AI-PCa cells, and altered key genes (KI67, CDKN2D, MMP9, PRPF40A, SST5TMD4, AR-v7, In1-ghrelin, EZH2) and oncogenic signalling pathways (p-AKT) involved in PCa aggressiveness. Interestingly, NST treatment also inhibited proliferation/migration only in AI-PCa cells and evoked an identical molecular response to GPR107- silencing. Finally, NST decreased GPR107 expression exclusively in AI-PCa cells, suggesting that part of the specific antitumor effects linked to NST could be mediated through a GPR107-downregulation. Altogether, the results previously described (accepted in 2 scientific publications) provide solid evidence demonstrating that SST/CORT/NST system and SST-analogues could represent a potential therapeutic option for PCa, especially for CRPC. The results included in the second section indicate a specific dysregulation of the REC components in PCa-tissues compared with control samples, identifying the Poly(A)-Binding-Protein-Nuclear 1 (PABPN1) factor as a critical regulator of crucial cancer hallmarks. Specifically, PABPN1 was consistently overexpressed (at mRNA and protein levels) in different human PCa cohorts and associated with poor progression, invasion and metastasis. Furthermore, PABPN1 silencing decreased relevant cancer hallmarks (proliferation, migration, tumourspheres, colonies, etc.) in multiple PCa models through the modulation of specific long non-coding RNAs (lncRNAs: PCA3, FALEC, DLEU2) and mRNAs (CDK2, CDK6, CDKN1A) that are relevant in the agresiveness of cancer. Interestingly, plasma PABPN1 levels were altered in patients with metastatic and tumour relapse showing also a potential prognostic value for PCa. Finally, pharmacological inhibition of the REC activity using isoginkgetin drastically inhibited PCa-cell aggressiveness suggesting a potential utility for the treatment of PCa. All this information indicates that the REC is drastically dysregulated in PCa, wherein this novel molecular mechanism, especially the alteration of PABPN1, may be potentially exploited as a novel prognostic and therapeutic tool for PCa. Taken together, the results obtained from this Doctoral Thesis demonstrate that key components of the SST/CORT/NST system and the REC are deeply dysregulated in PCa, wherein they play a crucial pathophysiological role in the development and progression of this disease. Therefore, the information generated here offers a better understanding of the cellular and molecular biology of PCa and points out these regulatory systems as potential sources of new diagnostic, prognostic, and therapeutic tools for the management of this devastating pathology.