Identification and characterization of metabolites from necrotrophic fungi

Abstract

Phytopathogenic fungi present a great problem, since they reduce the quality of crops and even decrease their yield, causing large economic losses to farmers. For this reason, the present work is divided into two main sections: the first one is dedicated to identifying compounds involved in the disease development of necrotrophic fungi, such as Ascochyta and Colletotrichum, while the second section aims to explore the potential use of these identified compounds as natural biofungicides. To this end, the work has been divided into the following chapters, which have given rise to their respective scientific publications: • Chapter I presents a general introduction on the importance of necrotrophic fungi on legumes. We review and discuss the isolation, chemical, and biological characterization of fungal phytotoxins produced by the most important necrotrophic fungi involved in legume diseases. We also report their possible role in plant-pathogen interaction and their structure-toxicity relationship. Moreover, we describe several multidisciplinary studies on other prominent biological activity conducted on reviewed phytotoxins. Finally, we explore the challenges in the identification of new fungal metabolites and their possible applications in future experiments. • Chapter II explore the possibility to integrate the OSMAC strategy for the identification of phytotoxic metabolites produced by the fungus Ascochyta fabae. For this, the fungus was grown in different culture media (solid and liquid) to obtain the respective fungal extracts that were fractionated by chromatographic methods and identified by NMR and LC-HRMS. Finally, a bioassay on detached leaves of several legume hosts was carried out to assess theis phytotoxicity and their role in disease development. • Chapter III reported the integration of the OSMAC strategy with targeted and untargeted metabolomic approaches to shed light on the secondary phytotoxic metabolite panels produced by pathogenic isolates of Colletotrichum truncatum and Colletotrichum trifolii. The phytotoxicity of the fungal crude extracts was also assessed on their primary hosts and related legumes, and the results correlated with the metabolite profile that arose from the different cultural conditions. • Chapter IV addresses the issue of the use of metabolites of natural origin for their use as possible biofungicides, as an alternative to chemicals. For this, the potential antifungal activity of some anthraquinones isolated from Ascochyta lentis, was assayed in this study for their effectiveness to reduce rust and powdery mildew diseases on pea and oat. Their effect on fungal development was macro- and microscopically assessed on inoculated leavesand compared to the control achieved by the chemical fungicide (Tetraconazol 12.5% and Azoxystrobin 25%). In addition, the most promising compound represented by pachybasin was also tested at different concentrations in inoculated whole plants in order to evaluate its preventive and curative potential against fungal infection. • Chapter V explore de fungitoxic effect of 12 bioactive plant and fungal metabolites belonging to different class of natural compounds on the pea powdery mildew incited by the pathogen Erysiphe pisi. Metabolites were tested, together with a commercial fungicide, at different concentrations on detached pea leaves for their potential to inhibit spore germination and subsequent stages of fungal growth. In addition, the most effective metabolites were tested at different concentrations in planta under controlled conditions to evaluate the level of control achieved by treatments before, concurrently and after pathogen inoculation. Pathogen development was macroscopically scored on whole plants as percentage of disease severity and area under the disease progress curve.

Los hongos fitopatógenos presentan un gran problema, ya que reducen la calidad de los cultivos e incluso disminuyen su rendimiento, provocando grandes pérdidas económicas a los agricultores. Por este motivo, el presente trabajo se divide en dos secciones principales: la primera está dedicada a identificar compuestos implicados en el desarrollo de enfermedades de hongos necrotróficos, como Ascochyta y Colletotrichum, mientras que la segunda sección tiene como objetivo explorar el uso potencial de estos compuestos identificados como biofungicidas naturales. Para ello, el trabajo se ha dividido en los siguientes capítulos, que han dado lugar a sus respectivas publicaciones científicas: • El Capítulo I presenta una introducción general donde se aborda la importancia de los hongos necrotrofos en los cultivos de las principales leguminosas de interés agronómico, y la relación planta-patógeno que se establece, así como las características de desarrollo de las diferentes enfermedades tratadas. Revisamos y discutimos el aislamiento y la caracterización química y biológica de las fitotoxinas fúngicas producidas por los hongos necrotróficos más importantes involucrados en las enfermedades de las leguminosas. También informamos su posible papel en la interacción planta-patógeno y su relación estructura-toxicidad. Además, describimos varios estudios multidisciplinarios sobre otras actividades biológicas destacadas realizadas con fitotoxinas previamente aisladas. Finalmente, exploramos los desafíos en la identificación de nuevos metabolitos fúngicos y sus posibles aplicaciones en experimentos futuros. • El Capítulo II explora la posibilidad de integrar la estrategia OSMAC para la identificación de metabolitos fitotóxicos producidos por el hongo Ascochyta fabae. Para esto, el hongo se cultivó en diferentes medios de cultivo (tanto sólidos como líquidos) para obtener los respectivos extractos fúngicos que fueron posteriormente fraccionados por métodos cromatográficos e identificados por RMN y LC-HRMS. Finalmente, se llevó a cabo un bioensayo en hojas cortadas de habas (su huespéd primario) y de otras leguminosas relacionadas para evaluar su fitotoxicidad y su papel en el desarrollo de la enfermedad. • El Capítulo III estudió aplicabilidad de la integración de la estrategia OSMAC con enfoques metabolómicos tanto dirigidos como no dirigidos para identificar los conjuntos de metabolitos fitotóxicos secundarios producidos por aislados de hongos patógenos de Colletotrichum truncatum y Colletotrichum trifolii. También se evaluó la fitotoxicidad de los extractos crudos de dichos hongos en sus huéspedes primarios y leguminosas relacionadas, y los resultados se correlacionaron con el perfil de metabolitos que surgió de las diferentes condiciones culturales testadas. • En el capítulo IV se aborda la problemática de los fungicidas aplicando diferentes metabolitos aislados de A. lentis como posibles biofungicidas frente a hongos biotrofos como la roya o el oidio en leguminosas y cereales. Para ello, primero se realizó un trabajo previo en hoja cortada de estas especies de planta y tras seleccionar el que mejor se adapta al nivel de un fungicida comercial, se aplicó en planta completa para ver cómo actúa a diferentes tiempos de aplicación conforme llega y actúa la enfermedad. • El Capítulo IV aborda el tema del uso de metabolitos de origen natural para su uso como posibles biofungicidas, como alternativa a los químicos frecuentemente usados. Para ello, en este estudio se analizó la potencial actividad antifúngica de algunas antraquinonas aisladas del hongo Ascochyta lentis (responsable de la ascoquitosis en lentejas) para reducir el desarrollo de la roya y el oidio en guisantes y avena. Su efecto sobre el desarrollo fúngico se evaluó macro y microscópicamente en hojas inoculadas y se comparó con el control logrado con los fungicidas químicos específicos de cada enfermedad. Además, el compuesto más prometedor representado por la pachibasina también se probó a diferentes concentraciones en plantas enteras inoculadas para evaluar su potencial preventivo y curativo contra el desarrollo de la enfermedad. • Finalmente, el Capítulo V comprueba el efecto fungitóxico de 12 metabolitos pertenecientes a diferentes clases de compuestos naturales contra el oidio del guisante causado por el patógeno Erysiphe pisi. Se testaron los metabolitos, junto con un fungicida comercial, en diferentes concentraciones en ensayos de hojas cortadas de guisantes para determinar su potencial para inhibir tanto los estadios tempranos de desarrollo del hongo, como la germinación de esporas, como las etapas posteriores de crecimiento. Además, los metabolitos más prometedores y efectivos se aplicaron en plantas enteras a diferentes concentraciones en condiciones controladas de crecimiento para evaluar el nivel de control logrado por los tratamientos antes, en paralelo y después de la inoculación con el patógeno. De esta manera se pudo evaluar el potencial fungicida tanto sistémico como curativo de cada compuesto seleccionado.