Common bean T2 S-like ribonucleases during situations of high nutrient mobilization

Abstract

Nucleic acids are relatively abundant organic compounds with essential functions within living organisms. In addition, due to their carbon, nitrogen and phosphorus content, they can play an important role as a reservoir of nutrients and play a key role in situations of high nutrient mobilization. Among nucleic acids, RNA is the most abundant molecule in plant cells, representing about 85% of total nucleic acids and 47% of total phosphorus. Ribonucleases are the enzymes that catalyse the degradation of RNA into smaller compounds; being the T2 family the most widespread among living organisms. In plants, T2 ribonucleases are classified into 2 subfamilies (S and S-like) and 3 classes and are involved in several processes such as defence, nutrient recycling, pollen recognition and maintenance of homeostasis. In this work, the involvement of class I (represented in bean by the PvRNS1, PvRNS2 and PvRNS3 genes) and classs II (PvRNS4) ribonucleases that compose the S-Like family has been studied in common bean. The main objective of this work was to determine the role of nucleic acids as biomolecules precursors in situations of high nutrient mobilization. For this purpose, T2 S-like ribonucleases were analysed during cotyledon ontogeny, from the first day after the start of imbibition until day 10, coinciding with cotyledon senescence. PvRNS1, PvRNS2 and PvRNS4 genes increased their expression in the nutrient mobilization phase in cotyledons, coinciding with an increase in ribonuclease activity during this phase. These results establish that T2 S-like ribonucleases are involved in RNA turnover in cotyledons during seedling development. Nucleic acid metabolism has also been determined in another process involving high nutrient mobilisation, fruit development. The activity and expression of nucleases was detected mainly in the seed coat, while in the case of ribonucleases, in addition to the seed coat, it was also detected in valves. In thecase of nucleotidases and nucleosidases, higher activity and expression wasfound in valves and seed coat. Overall, the data obtained lead to the conclusion that there is an intense nucleotide metabolism during the seed filling phase, with a special involvement of the seed coat in the process. Ribonuclease activity was also elevated in the testa during seed germination. This high activity correlated with a high level of PvRNS3 ribonuclease gene expression. The apparent involvement of PvRNS3 in seed formation in fruits, as well as in subsequent seed germination, led to overexpression of the protein encoded by this gene as a recombinant protein in E.coli. The purified protein exhibited total RNA, rRNA and tRNA degrading activity, but did not degrade single or doublestranded DNA, confirming that it is a functional ribonuclease.

Los ácidos nucleicos son compuestos orgánicos relativamente abundantes y con funciones esenciales dentro de los seres vivos. Además, debido a su contenido en carbono, nitrógeno y fósforo, pueden desarrollar un papel importante como reservorio de nutrientes y jugar un papel fundamental en situaciones de alta movilización de nutrientes. Entre los ácidos nucleicos, el ARN es la molécula más abundante en las células vegetales, representando alrededor del 85% del total de ácidos nucleicos y el 47% del total de fósforo. Las ribonucleasas son las enzimas que catalizan la degradación de ARN en compuestos más pequeños; siendo la familia T2 la más extendida entre los seres vivos. En plantas, las ribonucleasas T2 se clasifican en 2 subfamilias (S y S-like) y 3 clases e intervienen en diversos procesos tal y como defensa, reciclaje de nutrientes, reconocimiento o rechazo del polen o mantenimiento de la homeostasis. En este trabajo se ha estudiado en judía la implicación de las ribonucleasas de clase I (representadas en judía por los genes PvRNS1, PvRNS2 y PvRNS3) y de clase II (PvRNS4) que componen la familia S-Like. El objetivo principal de este trabajo ha sido determinar el papel de los ácidos nucleicos como precursores de biomoléculas en situaciones de alta movilización de nutrientes. Para ello las ribonucleasas T2 S-like se han analizado durante la ontogenia de los cotiledones, desde el primer día tras el inicio de la imbibición hasta el día 10, coincidiendo con la senescencia de estos. Los genes PvRNS1, PvRNS2 y PvRNS4 incrementaron su expresión en la fase de movilización de nutrientes en cotiledones, lo que coincidió con un aumento en la actividad ribonucleasa en esta fase. Estos resultados establecen que las ribonucleasas T2 S-like están involucradas en el reciclaje de ARN en los cotiledones durante el desarrollo de las plántulas. El metabolismo de ácidos nucleicos también se ha determinado en otro proceso que implica alta movilización de nutrientes, el desarrollo del fruto. La actividad y expresión de nucleasas se detectó principalmente en la cubierta de las semillas, mientras que, en el caso de las ribonucleasas, además de en la cubierta de las semillas, también se detectó en valvas. En el caso de las nucleotidasas y las nucleosidasas, se determinó una mayor actividad y expresión en valvas y en la cubierta de las semillas. En conjunto, los datos obtenidos permiten concluir que existe un intenso metabolismo de nucleótidos durante la fase de llenado de semillas, con una especial implicación de las cubiertas de las semillas en el proceso. La actividad ribonucleasa fue igualmente elevada en la testa de la semilla durante la germinación de la semilla. Esta elevada actividad se correlacionó con un alto nivel de expresión de la ribonucleasa PvRNS3. La aparente implicación de PvRNS3 en la formación de la semilla en frutos, así como en la posterior germinación de la semilla, condujeron a la sobreexpresión de la proteína codificada por este gen como proteína recombinante en E.coli. La proteína purificada presentó actividad degradadora de ARN total, ARNr ARNt, pero no degradó ADN de simple o doble cadena, lo que confirma que se trata de una ribonucleasa funcional.