Identificación, caracterización de pequeños RNAs y dianas implicadas en la degradación de residuos cianurados de la joyería por Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344

Abstract

Los contaminantes suponen un grave problema medioambiental y de salud pública, especialmente aquellos residuos industriales tóxicos que contiene cianuro y metales pesados procedentes de las industrias joyera y minera. El cianuro es un compuesto de elevada toxicidad que inhibe metalo-enzimas esenciales como la citocromo c oxidasa de la cadena de transporte de electrones. Aunque tradicionalmente se han usado métodos físico-químicos para tratar los residuos cianurados, la utilización de técnicas de biorremediación mediante el empleo de microorganismos cianotrofos que asimilan cianuro ofrecen una alternativa más sostenible y segura. Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 es una bacteria alcalófila y cianotrofa que asimila cianuro libre, complejos cianuro-metálicos y otros compuestos cianoderivados en condiciones alcalinas, minimizando así la formación de ácido cianhídrico e incrementado la eficiencia y seguridad del proceso de degradación de cianuro. Esta bacteria presenta una oxidasa terminal insensible a cianuro CioAB y una nitrilasa NitC esencial para la asimilación de cianuro. Estos procesos de resistencia y asimilación de cianuro están conectados por una malato:quinona oxidorreductasa, la cual proporciona, por un lado, electrones a CioAB para llevar a cabo la respiración celular, y por otro oxalacetato, que reacciona con el cianuro para formar la cianhidrina que utiliza como sustrato NitC. Se han descrito diferentes bacterias cianotrofas y rutas de asimilación de cianuro, aunque la regulación de este proceso no ha sido caracterizada en detalle hasta la fecha. Este trabajo se ha centrado en la identificación de pequeños RNAs en P. pseudoalcaligenes CECT 5344 que participan en la regulación de la biodegradación del cianuro presente en los residuos generados por la industria joyera. Mediante RNA-Seq se han identificado 16 pequeños RNAs con posibles funciones reguladoras, los cuales se encontraron diferencialmente expresados con el residuo de la joyería. De todos los pequeños RNAs identificados, sRNA649, sRNA14 y sRNA222, los cuales se encontraron inducidos por cianuro, fueron los que presentaron un mayor número de dianas, entre las que se incluyen genes pertenecientes a las agrupaciones génicas nit1C, cioAB-nit4, ure y gln. Una de las dianas específicas de sRNA649 fue un transportador de citrato DctM. La caracterización fisiológica con el residuo de la joyería o metales del mutante DctM ─ de P. pseudoalcaligenes CECT 5344 ha revelado, por su deficiencia para crecer en presencia de metales, que el citrato puede ser una molécula clave para que la degradación de cianuro se realice en condiciones óptimas, ya que este ácido tricarboxílico podría actuar como un quelante de hierro en condiciones cianotróficas. Se ha demostrado en estudios previos que la adición de citrato al medio de cultivo de la estirpe CECT 5344 provoca una degradación de concentraciones más elevadas de cianuro en reactor. La agrupación génica cioAB-nit4 codifica la nitrilasa Nit4, responsable de la asimilación de 3-cianoalanina en la estirpe CECT 5344 en presencia de cianuro. Aunque esta estirpe carece de una 3-cianoalanina sintasa funcional, el análisis del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT 5344 reveló la existencia de posibles vestigios de una 3-cianoalanina sintasa en esta estirpe. Además, una caracterización fisiológica y proteómica de los mutantes Nit4 ─ y NitC ─ ha permitido dilucidar una nueva ruta de asimilación de 3-cianoalanina a través de la nitrilasa NitC, la cual utiliza como sustrato un hipotético nitrilo que es generado tras la desaminación del grupo α-amino de la 3-cianoalanina. Esta ruta alternativa tiene lugar en ausencia de cianuro, condiciones en las que Nit4 no se expresa. El fenotipo del mutante doble NitC ─/Nit4 ─ en presencia de cianuro indicó que la 3-cianoalanina es asimilada principalmente a través de la nitrilasa Nit4, aunque también estaría implicada la nitrilasa NitC. Por otro lado, se ha abordado un estudio proteómico detallado de la respuesta a cianuro de P. pseudoalcaligenes CECT 5344. Entre los procesos inducidos por cianuro se han encontrado la resistencia y asimilación de cianuro, homeostasis de metales, metabolismo de aminoácidos y biosíntesis de cofactores, asimilación de fuentes de nitrógeno alternativas y respuesta frente a estrés oxidativo. Un análisis mutacional de los mutantes Nit ─ de P. pseudoalcaligenes CECT 5344 ha revelado que la mayoría de las proteínas codificadas por la agrupación génica nit1C son importantes para la degradación de cianuro, con especial relevancia de las proteínas NitA, NitB, NitC y NitE. Además, se ha llevado a cabo un análisis proteómico de los mutantes Nit ─ en condiciones cianotróficas, estableciéndose una relación entre estas proteínas y los procesos asimilación/resistencia a cianuro, homeostasis de metales, asimilación de otras fuentes nitrogenadas, con especial énfasis en la ruta de biosíntesis de arginina, metabolismo de nucleótidos biosíntesis de cofactores, como el ácido fólico, y formación de biofilm. La L-arginina se ha descrito como una molécula relevante para la formación de biofilm. Además, el tetrahidrofolato tiene un papel crucial como cofactor en varios pasos de la síntesis de novo de purinas, así como de forma indirecta en la modificación de algunas bases nitrogenadas pirimidínicas.

Contaminants pose a serious environmental and public health problem, especially toxic industrial wastes containing cyanide and heavy metals from the jewellery and mining industries. Cyanide is a highly toxic compound that inhibits essential metalloenzymes such as cytochrome c oxidase in the electron transport chain. Although physico-chemical methods have traditionally been used to treat cyanide-containing waste, the use of bioremediation techniques involving cyanotrophic microorganisms that assimilate cyanide offers a more sustainable and safer alternative. Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 is an alkalophilic and cyanotrophic bacterium that assimilates free cyanide, cyanide-metal complexes, and other cyanoderivatives under alkaline conditions, thus minimizing the formation of hydrogen cyanide and increasing the efficiency and safety of the cyanide degradation process. This bacterium possesses a cyanide-insensitive terminal oxidase (CioAB) and a nitrilase (NitC) essential for cyanide assimilation. These cyanide resistance and assimilation processes are connected by a malate:quinone oxidoreductase, which provides electrons to CioAB for cellular respiration and produces oxaloacetate that reacts with cyanide to form the cyanohydrin substrate utilized by NitC. Various cyanotrophic bacteria and cyanide assimilation pathways have been described so far, but the regulation of this process has not been thoroughly characterized to date. This study is focused on identifying small RNAs involved in the regulation of cyanide biodegradation in jewellery waste by P. pseudoalcaligenes CECT 5344. Through RNA-Seq, 16 small RNAs with potential regulatory functions were identified, and their expression was found to be upregulated by the jewellery waste. Of all the identified small RNAs, sRNA649, sRNA14, and sRNA222, which were induced by cyanide, had the highest number of targets. These targets include genes that belong to the nit1C, cioAB-nit4, ure, and gln gene clusters. One specific target of sRNA649 was the citrate transporter DctM. Physiological characterization of the DctM ─ mutant of Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 grown in the presence with jewellery waste or metals revealed that citrate could be a key molecule for optimal cyanide degradation. Under cyanotrophic conditions, citrate may act as an iron chelator. Previous studies have demonstrated that addition of the citrate in the culture medium of the strain CECT 5344 leads to the degradation of higher cyanide concentrations in a reactor. The cioAB-nit4 gene cluster encodes the nitrilase Nit4, responsible for the assimilation of 3-cyanoalanine in the strain CECT 5344 in the presence of cyanide. Although this strain lacks a functional 3-cyanoalanine synthase, genome analysis of Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 revealed possible remnants of a 3-cyanoalanine synthase in this bacterium. Furthermore, physiological and proteomic characterization of Nit4 ─ and NitC ─ mutants has elucidated a novel pathway for 3-cyanoalanine assimilation through the NitC nitrilase. This pathway utilizes a hypothetical nitrile generated after the α-amino group deamination of 3-cyanoalanine. This alternative route occurs in the absence of cyanide, a condition under which Nit4 is not expressed. The phenotype of the NitC ─/Nit4 ─ double mutant in the presence of cyanide indicates that 3-cyanoalanine is primarily assimilated via the Nit4 nitrilase, although NitC may also be involved. Additionally, a detailed proteomic study of the response of P. pseudoalcaligenes CECT 5344 to cyanide has been undertaken. Among the processes induced by cyanide, we have identified cyanide resistance and assimilation, metal homeostasis, amino acid metabolism, cofactor biosynthesis, assimilation of alternative nitrogen sources, and response to oxidative stress. An analysis of Nit ─ mutants in Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 has revealed that most proteins encoded by the nit1C gene cluster are important for cyanide degradation, with special relevance to the NitA, NitB, NitC, and NitE proteins. Additionally, a proteomic analysis of Nit ─ mutants under cyanotrophic conditions has established a relationship between these proteins and cyanide assimilation/resistance, metal homeostasis, assimilation of other nitrogen sources, with particular emphasis on the arginine biosynthesis pathway, nucleotide metabolism, and cofactor biosynthesis, such as folic acid. Larginine has been described as a relevant molecule for biofilm formation. Furthermore, tetrahydrofolate plays a crucial role as a cofactor in several steps of de novo purine synthesis, as well as indirectly in the modification of certain pyrimidine nitrogenous bases.