Diversidad genética y patogénica de Sclerotium rofsii Sacc. como factor determinante de epidemias de podredumbre de raíces

Abstract

Las epidemias causadas por el hongo de suelo Sclerotium rolfsii en numerosos cultivos agrícolas de interés económico siguen siendo de las de más difícil manejo, constituyendo aún, por tanto, un importante reto para los fitopatólogos. La dificultad de su manejo está motivada por diversas características de este patógeno, que incluyen el inusual rango de plantas huésped, su amplia distribución en suelos agrícolas a nivel mundial, su poderoso mecanismo de patogénesis con la producción exógena de encimas degradadoras de la pared celular del huésped, su capacidad para desarrollarse en un amplio rango de condiciones ambientales y su habilidad de persistir en los suelos infestados durante largos períodos de tiempo mediante la formación de estructuras de supervivencia o esclerocios, lo que unido con la recientemente demostrada variabilidad genética de sus poblaciones hacen de este patógeno uno de los de más difícil manejo. Las epidemias causadas por S. rolfsii son especialmente severas en zonas de clima templado y subtropical donde las elevadas temperaturas unidas a la elevada humedad de suelo proporcionada por la práctica del regadío dan lugar a condiciones favorables para el desarrollo del hongo, la infección y el rápido desarrollo de la enfermedad. En España, S. rolfsii se encuentra ampliamente distribuido en los suelos agrícolas del Valle del Guadalquivir y las provincias de Cádiz y Huelva en Andalucía. En esta área, las epidemias más severas causadas por S. rolfsii se han descrito en cultivos de remolacha azucarera de siembra otoñal, cuyos rendimientos suponen hasta el 40% de la producción total a nivel mundial de este tipo de siembra y siendo en esta región donde el cultivo está más avanzado desde el punto de vista tecnológico y productivo. A pesar de esto, no se han podido implementar hasta la fecha medidas eficientes para combatirlas. La coincidencia de los últimos riegos que recibe el cultivo con las altas temperaturas que se dan en la fecha de recolección, mayo-julio, ofrecen un escenario óptimo para el crecimiento y desarrollo de S. rolfsii y las enfermedades que causa referida como Podredumbre blanca o Mal del esclerocio. En la actualidad, se dispone de un limitado conocimiento acerca de la estructura y diversidad de las poblaciones de S. rolfsii, y éste es nulo en el caso de poblaciones infectando cultivos de remolacha azucarera. Este conocimiento, sería de especial interés para el diseño y desarrollo de medidas eficientes para el control integrado de las enfermedades causadas por este patógeno. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de dichas poblaciones procedentes de diversas áreas de cultivo de remolacha azucarera de diferentes regiones del mundo en las que se practica el mismo tipo de cultivo de siembra otoñal y bajo unas mismas condiciones climáticas de tipo Mediterráneo, con prevalencia de severas epidemias de Podredumbre blanca, y tiene como objetivo general el generar conocimiento sobre la Fitopatología de S. rolfsii en base a su diversidad molecular y patogénica, e inferir, así, la estructura de dichas poblaciones como base para el establecimiento medidas de control eficientes para el manejo de dicha enfermedad y desarrollar estudios epidemiológicos y de dispersión de sus poblaciones. Esta investigación es pionera en este importante hongo fitopatógeno al aunar la caracterización genética a diversos niveles, así como su caracterización patogénica y de virulencia en el estudio de poblaciones de S. rolfsii. En un primer nivel, la variabilidad genética de las poblaciones de S. rolfsii se evaluó mediante la ocurrencia de grupos de compatibilidad miceliar (GCMs) en una amplia colección de aislados del hongo y su distribución geográfica. Los GCM se establecen en base a las reacciones de compatibilidad-incompatibilidad entre los aislados enfrentados entre sí en un medio de cultivo apropiado. Sin embargo, se ha detectado cierta variabilidad en las características morfológicas de las reacciones incompatibles que a menudo dificulta la clara distinción de las reacciones miceliares entre aislados. Esta limitación asociada a las evidencias macroscópicas se solventó mediante el desarrollo en el transcurso de las primeras fases de esta investigación de un medio de cultivo (medio modificado de Patterson: MPM) que favorece la formación de la zona de aversión característica de las interacciones incompatibles entre aislados de S. rolfsii y permite la identificación inequívoca de las distintas reacciones miceliares. La determinación de los GCMs se considera como un método indirecto para el estudio de la variabilidad genética entre aislados de hongos fitopatógenos que carecen de fase sexual o ésta rara vez ha sido descrita y, por lo tanto, se considera irrelevante su papel en el ciclo vital. En estos hongos, entre los que se encuentra S. rolfsii, se considera que el intercambio genético se produce exclusivamente entre individuos del mismo GCM por lo que permanecen genéticamente aislados de los encuadrados en GCMs diferentes. Este aislamiento genético hace que estas poblaciones puedan diferir en características de tipo morfológico, genético o patogénico. Así, entre los 459 aislados de S. rolfsii estudiados en esta Tesis Doctoral procedentes de ocho localidades de Andalucía donde se llevaron a cabo muestreos intensos, así como de cuatro localidades de Chile, una de Italia y cinco de Portugal, se identificaron 12 GCMs. En las parcelas muestreadas intensamente en Andalucía el GCM i fue el más abundante, apareciendo en todas ellas como el único grupo presente o junto a otros representados por un menor número de aislados, excepto en una localidad (Lebrija) donde el GCM más abundante fue el iii, sugiriendo que el GCM i representa a la población original de S. rolfsii en Andalucía. Considerando a la totalidad de parcelas muestreadas, el GCM iii fue el más ampliamente distribuido geográficamente ya que fue identificado en 10 de las 18 localidades estudiadas y en todos los países muestreados excepto en Italia. Esto sugeriría que el GCM iii pudo haber sido el que ha sufrido una dispersión más amplia tanto dentro de una misma zona de cultivo como entre áreas de cultivo, por prácticas culturales como por el desplazamiento de vehículos y/o material vegetal. El resto de GCMs identificados mostraron cierta correlación con el origen geográfico de los aislados al estar localmente distribuidos en varias localidades de diferentes países (GCM v), localidades dentro de un país (GCM ii, vi y ix) o en una sola localidad (iv, vii, viii, x, xi, y xii). Una de las hipótesis de partida en esta Tesis Doctoral fue que los aislados pertenecientes a un mismo GCM serían más similares genéticamente entre sí que a aquellos de GCMs diferentes. En base a esto, se analizó la diversidad genética de los aislados de S. rolfsii dentro y entre los distintos GCMs identificados y sus relaciones filogenéticas. En una segunda aproximación, se exploró la posibilidad de encontrar marcadores moleculares para los GCMs que permitiesen su caracterización e identificación rápida y reproducible. Para ello, se realizaron análisis RFLP (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) del gen 5.8S del ADN ribosómico (ADNr) y las regiones espaciadoras internas ITS1/ITS2 que lo flanquean, mediante la digestión de los productos amplificados de dicha región con las enzimas de restricción AluI, RsaI, HpaII y MboI. Este análisis reveló la existencia de un nivel de variabilidad reducido entre aislados de S. rolfsii pertenecientes a los diferentes GCMs ya que los pertenecientes a un mismo GCM mostraron idénticos patrones de bandas para las cuatro enzimas, mientras que los 12 GCMs identificados se agruparon en tres grupos-RFLP que incluyeron entre uno, tres y ocho GCMs sin que existiese asociación con el origen geográfico de éstos. Por otro lado, dada la escasa resolución de esta aproximación para la adecuada caracterización de los aislados de S. rolfsii a nivel de GCM, se abordó el estudio de las secuencias nucleotídicas de regiones específicas de genes codificantes de proteínas ricos en intrones a lo largo de su secuencia, una herramienta molecular apenas explorada hasta la fecha para estudios de variabilidad molecular en S. rolfsii. Estas regiones se localizaron en el gen EF1α que codifica para el factor de elongación de la transcripción 1-alfa y en el gen RPB2 que codifica para la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II. Considerando ambas secuencias por separado, los análisis de similitud mostraron que los aislados de un mismo GCM compartían idéntica información nucleotídica y que además, era posible caracterizar a los GCMs atendiendo a sus secuencias, ya que eran únicas para la mayoría de ellos. Más aún, al combinar ambas regiones génicas, los 12 GCMs de S. rolfsii identificados fueron entonces resueltos, presentando cada uno de ellos secuencias nucleotídicas únicas que permitieron su completa caracterización. Este resultado se corroboró en “test ciegos” en los que nuevos aislados de S. rolfsii no incluidos en la colección inicial, fueron asignados a alguno de los GCMs previamente identificados mediante el análisis tanto de dichas secuencias génicas, con una similitud del 100%, como de las reacciones miceliares en enfrentamientos en medios de cultivo frente a los aislados “tipo” de cada los diferentes GCMs identificados. Por tanto, en la presente Tesis Doctoral se propone un set inicial de aislados “tipo” para la identificación de GCMs en S. rolfsii basada en secuencias específicas para cada uno de ellos de los genes EF1α y RPB2 que permita la rápida y correcta caracterización y clasificación de aislados individuales en los 12 GCMs identificados. Esta herramienta será de gran utilidad para una mejor compresión de la epidemiología de las enfermedades causadas por S. rolfsii así como en el estudio de la dispersión espacial y temporal de las poblaciones de éste. Finalmente, se abordó la caracterización patogénica y de virulencia de las poblaciones de S. rolfsii evaluadas en la presente Tesis Doctoral, así como su posible asociación con la variación genética encontrada en los distintos GCMs identificados, sobre un conjunto de 11 especies vegetales seleccionadas por representar al amplio rango de plantas huésped susceptibles que presenta S. rolfsii y por incluir, además, especies monoy dicotiledóneas de interés agrícola que podrían ser alternativas a los cultivos de remolacha azucarera de siembra otoñal en las zonas de producción de regiones con clima de tipo Mediterráneo y cuyas áreas se están reduciendo de manera constante como consecuencia de diferentes procesos de reconversión del cultivo. De este modo, a la hora de diseñar una adecuada rotación de cultivos, es necesario disponer de información a nivel local sobre la prevalencia de los GCMs presentes y de su espectro de plantas huésped susceptibles. Por otro lado, la rotación de cultivos se presenta como una de las pocas medidas de control para la Podredumbre blanca al contribuir a la reducción del inóculo del patógeno en los suelos infestados y al mantenimiento del potencial productivo de los suelos agrícolas. No obstante, la eficiencia de esta medida dependerá de la reacción que los cultivos incluidos en la rotación presenten frente a las poblaciones del patógeno. En consecuencia, esta investigación respondió a la necesidad de generar conocimiento acerca de los rangos de plantas huésped susceptibles a los distintos GCMs en las regiones de estudio de clima de tipo Mediterráneo y donde esta información no está disponible en la literatura científica. Los resultados obtenidos demostraron que existe una elevada variabilidad patogénica entre los aislados representativos de los diferentes GCMs, así como en el grado de susceptibilidad entre las especies de plantas huésped evaluadas con una interacción significativa entre los grupos de GCMs x especies huésped. El análisis de agregación permitió seleccionar cinco grupos de GCMs y agrupar las especies huésped en el grupo-especies 1 (brócoli, garbanzo, girasol y tomate) y 2 (algodón, pimiento, remolacha azucarera y sandía). Los grupos-GCM 1 (GCMs i y ix), 2 (GCMs ii, iii, vi y viii) y 5 (x, xii) fueron moderadamente virulentos sobre el grupo-especies 1 y ligeramente virulentos frente al grupo-especies 2. En cambio, los grupos-GCM 3 (GCMs iv, v y xi) y 4 (GCM vii) fueron ligeramente virulentos sobre ambos grupos de especies. De la misma forma, para el conjunto de los 12 GCMs, la reacción media de las diferentes especies de plantas huésped se estimó como: altamente susceptible (garbanzo y girasol), susceptible (algodón, pimiento, tomate y sandía), moderadamente resistente (brócoli, melón y remolacha azucarera) y resistente (maíz y trigo). Además, cabe destacar que entre los aislados de S. rolfsii pertenecientes a un mismo GCM, existe un bajo nivel de variabilidad patogénica, lo cual sugiere una correlación entre los componentes de un GCM y su capacidad patogénica y de virulencia. En base a estos resultados que muestran claras diferencias en virulencia entre los diferentes aislados de S. rolfsii, asociadas además a la diversidad genética de los mismos determinada por los GCMs en los que se agrupan, junto con la ocurrencia de hasta tres GCMs diferentes en una misma parcela o localidad, dificultan la recomendación de la rotación de cultivos como única medida de control frente a la Podredumbre blanca. Esta Tesis Doctoral ha permitido explorar por vez primera el estudio y caracterización de la estructura genética y patogénica de las poblaciones de S. rolfsii infectando cultivos de remolacha azucarera de siembra otoñal en regiones de clima de tipo Mediterráneo. La información generada en la presente Tesis Doctoral ha permitido establecer las bases para: (i) la inequívoca evaluación de las distintas reacciones miceliares entre los aislados de S. rolfsii; (ii) la identificación y caracterización rápida de GCMs en base a marcadores moleculares; (iii) el establecimiento de una colección de referencia de aislados representativos de GCMs para futuros estudios sobre las poblaciones del patógeno; y (iv) la caracterización de la reacción de un conjunto de especies de plantas huésped de interés económico y agrícola frente a las poblaciones de S. rolfsii prevalentes en áreas de clima Mediterráneo. Desde un punto de vista práctico, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral permitirán establecer medidas más eficientes de control de las enfermedades causadas por S. rolfsii tanto en remolacha azucarera como en otros alternativos que se establezcan en áreas con historia del patógeno. En base a nuestros resultados, dichas medidas deben estar basadas fundamentalmente en los principios de prevención y escape, y deberán ser implementadas mediante la utilización de cultivos no huésped del patógeno o con un nivel adecuado de resistencia a las poblaciones del mismo prevalentes en la zona de cultivo, así como la práctica de la rotación de cultivos que incluya preferentemente cultivos no huésped a S. rolfsii.