PRPF8 increases the aggressiveness of hepatocellular carcinoma by regulating FAK/AKT pathway via fibronectin 1 splicing

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) pathogenesis is associated with alterations in splicing machinery components (spliceosome and splicing factors) and aberrant expression of oncogenic splice variants. We aimed to analyze the expression and potential role of the spliceosome component PRPF8 (pre-mRNA processing factor 8) in HCC. PRPF8 expression (mRNA/protein) was analyzed in a retrospective cohort of HCC patients (n = 172 HCC and nontumor tissues) and validated in two in silico cohorts (TCGA and CPTAC). PRPF8 expression was silenced in liver cancer cell lines and in xenograft tumors to understand the functional and mechanistic consequences. In silico RNAseq and CLIPseq data were also analyzed. Our results indicate that PRPF8 is overexpressed in HCC and associated with increased tumor aggressiveness (patient survival, etc.), expression of HCC-related splice variants, and modulation of critical genes implicated in cancer-related pathways. PRPF8 silencing ameliorated aggressiveness in vitro and decreased tumor growth in vivo. Analysis of in silico CLIPseq data in HepG2 cells demonstrated that PRPF8 binds preferentially to exons of proteincoding genes, and RNAseq analysis showed that PRPF8 silencing alters splicing events in multiple genes. Integrated and in vitro analyses revealed that PRPF8 silencing modulates fibronectin (FN1) splicing, promoting the exclusion of exon 40.2, which is paramount for binding to integrins. Consistent with this finding, PRPF8 silencing reduced FAK/AKT phosphorylation and blunted stress fiber formation. Indeed, HepG2 and Hep3B cells exhibited a lower invasive capacity in membranes treated with conditioned medium from PRPF8-silenced cells compared to medium from scramble-treated cells. This study demonstrates that PRPF8 is overexpressed and associated with aggressiveness in HCC and plays important roles in hepatocarcinogenesis by altering FN1 splicing, FAK/AKT activation and stress fiber formation.

La patogénesis del carcinoma hepatocelular (CHC) está asociada a alteraciones en los componentes de la maquinaria de splicing (spliceosoma y factores de splicing) y a la expresión aberrante de variantes de splicing oncogénicas. El objetivo de este estudio fue analizar la expresión y el papel potencial del componente del spliceosoma PRPF8 (factor 8 de procesamiento del pre-mRNA) en el CHC. Se analizó la expresión de PRPF8 (ARNm/proteína) en una cohorte retrospectiva de pacientes con HCC (n = 172 HCC y tejidos no tumorales) y se validó en dos cohortes in silico (TCGA y CPTAC). Se silenció la expresión de PRPF8 en líneas celulares de cáncer de hígado y en tumores xenoinjertados para comprender las consecuencias funcionales y mecanísticas. También se analizaron datos in silico de RNAseq y CLIPseq. Nuestros resultados indican que PRPF8 se sobreexpresa en el CHC y se asocia con un aumento de la agresividad tumoral (supervivencia de los pacientes, etc.), con la expresión de variantes de splicing relacionadas con el CHC y con la modulación de genes críticos implicados en vías relacionadas con el cáncer. El silenciamiento de PRPF8 redujo la agresividad in vitro y el crecimiento tumoral in vivo. El análisis de datos de CLIPseq demostró que PRPF8 se une preferentemente a exones de genes codificadores de proteínas, y el análisis RNAseq mostró que el silenciamiento de PRPF8 altera los eventos de splicing en múltiples genes. Análisis integrados e in vitro revelaron que el silenciamiento de PRPF8 modula el splicing de fibronectina (FN1), promoviendo la exclusión del exón 40.2, que es primordial para la unión a integrinas. En consonancia con este hallazgo, el silenciamiento de PRPF8 redujo la fosforilación de FAK/AKT y bloqueó la formación de fibras de estrés. De hecho, las células HepG2 y Hep3B mostraron una menor capacidad invasiva en membranas tratadas con medio condicionado de células silenciadas con PRPF8 en comparación con el medio de células tratadas con el control.