Metabolómica global y orientada de cítricos mediante técnicas cromatográficas-espectrometría de masas

Abstract

1. Introducción o motivación de la tesis. La investigación desarrollada en esta Tesis Doctoral se centró en contribuciones en el ámbito de los cítricos a través de estrategias metabolómicas, tanto dirigidas como globales, mediante el uso tanto de cromatografía de líquidos (LC) como de cromatografía de gases (GC), ambas acopladas a espectrometría de masas (MS). Con este objetivo, en primer lugar se realizó una revisión exhaustiva y crítica de la bibliografía para conocer el estado de los estudios sobre cítricos, con especial énfasis en la obtención y potenciales aplicaciones de los compuestos bioactivos presentes en estos frutos. Estas revisiones pusieron de manifiesto las discrepancias entre los diferentes grupos de investigación, sobre todo con respecto a los métodos de extracción y pretratamiento de la muestra. Por ello, la Sección B de esta Tesis Doctoral se dedicó a estudiar el efecto del uso de energías auxiliares y del pretratamiento de muestra en la extracción de componentes de cítricos mediante análisis global, usando limón (Citrus limon) como modelo. Por otro lado, la investigación bibliográfica reveló la existencia de muy poca información sobre los cambios en el perfil de metabolitos de los cítricos durante el crecimiento del fruto, la cual se había realizado principalmente a través de métodos no selectivos como los basados en fotometría. Por esta razón, la Sección C de esta Tesis Doctoral se enfocó al análisis exhaustivo de muestras de lima (Citrus latifolia) las cuales se obtuvieron mediante un riguroso plan de muestreo desde la primera semana del nacimiento del fruto hasta su maduración comercial (14 semanas). El análisis metabolómico de las muestras, tanto global como dirigido, se realizó mediante plataformas analíticas basadas en LC–MS y GC–MS. Finalmente, la revisión bibliográfica desarrollada ha puesto de manifiesto las potenciales aportaciones a la salud de los compuestos bioactivos del limón, así como sus posibles usos en diferentes industrias como la farmacéutica, cosmética o alimentaria. 2. Contenido de la investigación. El contenido de la investigación realizada ha implicado: • Revisar y discutir de forma crítica y exhaustiva el estado actual de los estudios sobre cítricos. En esta Tesis Doctoral se presentan cuatro capítulos producto de la investigación bibliográfica dedicados a: (i) los usos potenciales de los residuos generados por la industria citrícola y los metabolitos presentes en ellos, con miras a un aprovechamiento integral del fruto; (ii) el efecto de los métodos de extracción y pretratamiento de muestra, las diferentes plataformas analíticas utilizas en estudios sobre cítricos y la importancia del uso de metodologías de optimización rigurosas; (iii) la importancia de compuestos bioactivos como los flavonoides o las cumarinas para la salud humana. • Desarrollar optimización multiobjetivo para la obtención de metabolitos de cítricos mediante extracción asistida por ultrasonidos (USAE), extracción asistida por microondas (MAE) y mediante líquidos sobrecalentados (SHLE). Para ello, se desarrollaron diseños experimentales de tipo Box-Behnken considerando los factores más importantes de cada tipo de extracción y la optimización se realizó mediante un método de deseabilidad que permitió encontrar las variables más adecuadas para; (i) maximizar simultáneamente la concentración de los 10 metabolitos más abundantes en los extractos; (ii) maximizar el contenido de una familia de compuestos, por ejemplo los compuestos fenólicos. • Evaluar el efecto de los métodos de extracción propuestos tanto para la extracción global de componentes del limón, como para la extracción particular de flavonoides. • Estudiar el efecto del pretratamiento de la muestra (liofilización y secado con aire) sobre el perfil de metabolitos en extractos de limón, tanto de forma global como dirigida a flavonoides. • Desarrollar un protocolo de muestreo para evitar al máximo los sesgos en la toma de muestras de lima durante su crecimiento. • Desarrollar plataformas analíticas para el estudio de las diferentes muestras basadas en: (i) LC–MS, usando un detector híbrido cuadrupolo–tiempo de vuelo de alta resolución para los análisis globales y un detector de triple cuadrupolo para los análisis dirigidos; (ii) GC–MS, usada tanto para el análisis de metabolitos polares y semi-polares derivatizados por sililación, así como para el análisis de los metabolitos volátiles obtenidos por microextracción en fase sólida del espacio de cabeza. • Aplicar herramientas quimiométricas para: (i) el tratamiento de los datos mediante análisis multivariado como análisis de varianza multivariada (ANOVA), análisis de componentes principales (PCA) y análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales (PLS-DA); (ii) la aplicación de modelos de trasformación de datos para combinar las señales (matrices) obtenidas mediante las diferentes plataformas analíticas utilizadas sin producir sesgos, es decir, que todas las señales obtenidas fueran tratadas con igual importancia, independientemente de su intensidad. 3. Conclusión. La investigación abarcada en esta Tesis Doctoral se dividió en 3 secciones. En primer lugar (Sección A), se realizó una amplia revisión bibliográfica, como se muestra en los Capítulos I al IV de la Memoria de Tesis. Esta búsqueda hizo posible la evaluación crítica de la situación tanto de los pretratamientos de la muestra como de los métodos de extracción para la obtención de compuestos bioactivos de los cítricos, mostrando sus deficiencias y proporcionando pautas para plantear la investigación sobre estos frutos a través de la metabolómica. Además revelaron los efectos beneficiosos de algunos compuestos bioactivos presentes en estos frutos, tales como flavonoides o cumarinas, así como de sus potenciales usos como nutracéuticos. Las Sección B se enfocó al estudio del efecto de las energías auxiliares y del pretratamiento de la muestra en la extracción de los componentes del limón utilizando análisis metabolómico global, del cual se obtuvieron las siguientes conclusiones: • Mediante análisis quimiométricos (PCA y ANOVA) se puso de manifiesto una discriminación clara entre métodos de extracción, especialmente causada por la diferente facilidad para separar flavonoides, azúcares y ácidos carboxílicos de las muestras. • Considerando los compuestos bioactivos polares, USAE proporcionó el mejor método en términos de tiempo de extracción y concentración de metabolitos en los extractos, seguida de MAE. • SHLE demostró ser poco favorable para la extracción de metabolitos de cítricos debido a la interferencia de la pectina o a su degradación a alta temperatura. Con respecto al efecto del pretratamiento de la muestra en la extracción de los metabolitos en cítricos, el análisis global permitió establecer las siguientes conclusiones: • El análisis no supervisado mediante PCA reveló una discriminación clara entre muestras que habían estado sometidas a diferentes pretratamientos. Los flavonoides, las cumarinas, los aminoácidos y los azúcares fueron los principales responsables de las diferencias. • Respecto a los flavonoides se observó un efecto muy claro: los extractos obtenidos con muestras liofilizadas contenían una mayor concentración de flavononas, pero más baja de flavonoles en comparación con los extractos procedentes de muestras secadas en corriente de aire. Las diferencias más claras entre pretratamientos de muestra se observaron en la extracción de cumarinas: se identificaron 7 cumarinas en los extractos de muestras secadas en corriente de aire y solo 3 en los de muestras liofilizadas. • A pesar de la creencia común de que el mejor modo de deshidratación de muestras es la liofilización, la elección de esta etapa es muy dependiente del objetivo del estudio y de los metabolitos en cuestión. La Sección C de esta Memoria de Tesis recoge los resultados de los estudios sobre los cambios de concentración de los metabolitos del limón persa durante el crecimiento del fruto, que se realizaron mediante ambos tipos de análisis, global y dirigido. Los hallazgos más destacables de estos estudios son los siguientes: • Se identificaron tentativamente mediante la información proporcionada por diferentes plataformas analíticas un total de 165 metabolitos (28 flavonoides, 7 ácidos fenólicos, 7 cumarinas, 22 ácidos carboxílicos, 18 azúcares, 19 aminoácidos, 37 volátiles, 5 lípidos, 6 alcoholes de azúcares y 16 compuestos pertenecientes a otras clases). La presencia de 26 de estos metabolitos se confirmó mediante estándares analíticos. Además, el comportamiento durante el crecimiento del fruto de todos los metabolitos tentativamente identificados se analizó mediante los tests de ANOVA y de rango múltiple (Tukey HSD) para evaluar la significancia de los cambios observados; poniendo así de manifiesto la semana que proporcionó la máxima concentración de cada metabolito. • El análisis no supervisado mediante PCA reveló una clara discriminación entre estados de maduración, principalmente debida a los cambios de concentración de fenoles, aminoácidos, azúcares, ácidos carboxílicos y volátiles. El análisis supervisado mediante PLS-DA mostró que los cambios en la concentración de los principales fenoles pueden utilizarse para diferenciar muestras correspondientes a diferentes semanas de crecimiento del cítrico. • Se comprobó la adecuación de la transformación Z para combinar matrices de datos de diferentes plataformas analíticas —que permite corregir la posible heteroscedasticidad causada por el uso de diferentes plataformas analíticas de GC–MS, consiguiendo una distribución más simétrica. • Finalmente, la información obtenida sobre la etapa de maduración que proporciona las mayores cantidades de metabolitos con alto valor añadido aumenta las posibilidades del uso de los cítricos como fuentes de bioproductos para una mejor explotación de las cosechas, especialmente en los años de sobreproducción. Un ejemplo de la utilidad de la información conseguida son los flavonoides. Esta subclase alcanza su máxima concentración en la semana 12 de la maduración, cuando el fruto posee entre 10 y 15% menos agua que en la semana 14, que corresponde a la madurez comercial. La recolección del fruto en la semana 12 requiere menos energía para la deshidratación sin disminución significativa del rendimiento en flavonoides.