Caracterización genética del complejo de las caseínas en la raza Murciano-Granadina

Abstract

En los últimos años, la producción de leche y queso de cabra ha aumentado considerablemente en todo el mundo, como resultado del aumento del consumo de productos lácteos. En este contexto, razas como la Murciano-Granadina y su asociación de criadores han tenido que adaptarse a las nuevas demandas del mercado y por lo tanto implementar programas de cría enfocados a la mejora de la cantidad, calidad y propiedades tecnológicas de la leche. La selección de reproductores, evaluando la conexión específica entre los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) y los fenotipos deseables permiten aumentar la productividad y la rentabilidad de las explotaciones. En este contexto, las caseínas presentes en la leche (αS1, αS2, β y κ), cuya expresión está regulada por cuatro loci (CSN1S1, CSN1S2, CSN2 y CSN3) agrupados dentro de una región de 250 kb en el cromosoma 6, son algunos de los rasgos económicamente más relevantes para la industria lechera. De este modo, el hilo conductor de la presente tesis doctoral es el estudio de la implicación de las caseínas en el rendimiento productivo de las cabras, tanto a nivel cuantitativo como cualitativo. En el primer trabajo se utilizaron ecuaciones de regresión categórica para predecir qué factores (genéticos y no genéticos) y a qué nivel pueden determinar el rendimiento de la leche (kg), la grasa (kg), la proteína (kg) y el extracto seco (kg). Se estudiaron 2090 registros de producción de leche y sus componentes en 710 cabras Murciano-Granadina organizadas de acuerdo a su genotipo para el locus CSN1S1. Todos los factores ambientales (año de la granja y del parto) y los factores inherentes a los animales (genotipo, tipo de nacimiento y edad) resultaron estadísticamente significativos (P < 0,05) excepto la estación y mes de parto. El efecto del genotipo CSN1S1 fue estadísticamente significativo y explicó del 8,3% al 9,2% de la variabilidad del contenido de proteínas y grasas. La combinación heterocigótica del alelo E con aquellos alelos que influyen fuerte o débilmente en el rendimiento de la leche y sus componentes, como son la presencia de los alelos A, B, B2, F y el genotipo homocigótico BB, mostraron el efecto significativamente más alto con respecto al rendimiento de la leche y sus componentes. Los resultados sugieren que las pruebas no paramétricas pueden reportar resultados contextualmente válidos cuando no es posible tener un tamaño de muestra grande. Siguiendo con los genotipos de la CSN1S1, en el segundo estudio se realizó una evaluación genética incluyendo y excluyendo el genotipo CSN1S1, para evaluar su repercusión en la eficiencia de los modelos de cría. A pesar de que no se encontraron diferencias significativas en cuanto a la producción de leche, grasa y materia seca, las proteínas aumentaron considerablemente al incluir el genotipo CSN1S1 en el modelo de cría (+0,23%). Los errores estándar sugirieron que la consideración del genotipo puede mejorar la eficiencia del modelo, traduciéndose en parámetros genéticos y valores de cría (PBV) más precisos. Las correlaciones genéticas oscilaron entre -0,15 y -0,01 entre la proteína/materia seca y la producción de leche/proteína y el contenido de grasa, mientras que las correlaciones fenotípicas fueron de - 0,02 para la leche/proteína y -0,01 para la leche/grasa o contenido de proteína. Para los machos, el rango más amplio de fiabilidad (RAP) (0,45-0,71) fue similar al de las hembras (0,37-0,86) cuando se incluyó el genotipo. Los rangos PVB se ampliaron, mientras que el máximo se mantuvo similar (0,61-0,77) para machos y hembras (0,62-0,81) cuando se excluyó el genotipo, respectivamente. Como se ha visto en ambos estudios, la consideración del genotipo para el locus CSN1S1 puede aumentar la eficiencia de la producción y la rentabilidad de la leche. Para el resto de los estudios se analizaron 2594 registros de producción y componentes de leche pertenecientes a 159 cabras del núcleo de selección y genotipados para 48 SNPs en los cuatro genes de las caseínas. En el tercer y cuarto artículo se evaluó el efecto de los factores no genéticos sobre la producción de leche, grasa, proteína, materia seca, lactosa y recuento de células somáticas, utilizando métodos de regresión lineal bayesiana (tercero) y métodos no paramétricos (cuarto). En ambos, los factores estudiados fueron: granja, número de cabritos nacidos, tipo de parto, nacidos vivos, mes de parto, estación de parto, año de parto, número de control, tipo de control, mes de control, estación de control, año de control, días de lactancia, días desde el primer control, días desde el último control hasta el secado, mes de secado, estación de secado y año de secado. En el tercer estudio, todos los factores estudiados influyeron significativamente en todas las variables estudiadas ya sea positiva o negativamente de ligera a moderadamente, como lo sugieren los valores de R2 que van del 21,5% al 47,5%, para el recuento de células somáticas (cs/mL) y la materia seca (kg), respectivamente. A pesar de que las combinaciones de factores no genéticos escogidos en este estudio pueden condicionar significativamente la producción de leche y sus componentes, en el caso del recuento de células somáticas, otros factores significativos adicionales, como la incidencia o prevalencia de enfermedades, cuyos efectos no fueron controlados, también podrían estar implicados en el ganado caprino. En el cuarto estudio, todos los factores evaluados presentaron una influencia significativa (P < 0,0001) en todas las variables estudiadas, con la excepción del número de cabritos nacidos muertos, que no influyeron significativamente en cada componente y el año de secado, que no influyó significativamente en el contenido de materia seca. Como se observó en ambos estudios, los factores no genéticos afectan a la producción de leche y a su composición en la raza caprina Murciano-Granadina. Además, la inclusión del tipo de control de leche y los parámetros relacionados con la estación de secado como efecto fijo en los modelos de predicción del rendimiento de la leche y su composición pueden proporcionar información interesante, que debe incluirse en las evaluaciones genéticas para promover una producción de leche de mayor y mejor calidad. En el quinto trabajo se realizó un estudio de asociación para evaluar los efectos aditivos y de dominancia de 48 SNPs presentes en el complejo de genes de las caseínas sobre la composición y la calidad de la leche mediante pruebas no paramétricas y análisis de los componentes principales. Se detectaron efectos significativos sobre la producción de leche y componentes de dos deleciones en el exón 4 (CSN1S1 y CSN3), una en el exón 7 (CSN2) y otra en el exón 15 (CSN1S2) a frecuencias que oscilan entre 0,12 y 0,50. La corrección de Bonferroni fue utilizada para prevenir los efectos de la posible multicolinealidad derivada de la consideración de un elevado número de SNPs. Los exones 15 y 7 se asociaron significativamente con el rendimiento de la leche y sus componentes, excepto la lactosa y las células somáticas, mientras que el exón 4 se asoció significativamente con el rendimiento de la leche y sus componentes, excepto la proteína y la materia seca. Las asociaciones de los SNPs con las células somáticas fueron menos frecuentes y más débiles que las de la producción de leche y sus componentes. A medida que las caseínas aumentan, las células somáticas disminuyen, lo que reduce la actividad enzimática de la leche y la idoneidad para el consumo. Por consiguiente, la inclusión de información molecular en los planes de cría puede promover la eficiencia de la producción, ya que la selección contra los alelos indeseables podría evitar los compromisos derivados de sus efectos de dominancia. En este sentido, en el sexto estudio se evaluaron las interacciones epistáticas entre SNPs, una vez habían sido cuantificados y aislados los efectos aditivos y de dominancia entre el complejo de la caseína en el artículo anterior. De este modo, el objetivo de este trabajo fue cuantificar las interacciones epistáticas entre 48 SNPs del complejo de la caseína en los niveles de expresión de grasa, proteína, materia seca, lactosa y células somáticas. Se utilizó un análisis categórico de componentes principales (CATPCA) como función para limitar y agrupar el número de SNPs estudiados según su relevancia en cuanto a la explicación de la varianza en el rendimiento de la leche y los componentes. Posteriormente, se realizó un análisis de correlaciones canónicas no lineales (OVERALS) para identificar las relaciones entre los SNPs agrupados por el CATPCA. La solución bidimensional para OVERALS explicó el 79,65% de la varianza total de los rasgos fenotípicos evaluados en los grupos de SNPs (57,56% de la varianza para la primera dimensión y 42,43% para la segunda dimensión). De los 48 SNPs evaluados, el SNP18 fue el más frecuente (carga de componentes > |0,5|, para la dimensión 2) y uno de los más relevantes a la hora de explicar la variabilidad epistática intergrupal para la producción de leche y los componentes. En el séptimo estudio, se incluyó en los modelos genéticos de los SNPs del complejo de la caseína, el efecto aditivo, dominante y epistático para estimar los parámetros genéticos (heredabilidad y componentes de la varianza) y los valores de cría y sus precisiones para el rendimiento y los componentes de la leche. La heredabilidad de la producción de leche, la lactosa y el recuento de células somáticas aumentó considerablemente cuando se consideró el modelo que incluía los efectos genéticos (0,46, 0,30 y 0,43, respectivamente). Los errores de predicción estándar de los componentes disminuyeron y la precisión y fiabilidad aumentaron cuando se consideraron los efectos genéticos. En conclusión, la inclusión de los efectos genéticos y las relaciones entre estos biomarcadores hereditarios puede mejorar la eficiencia del modelo, los parámetros genéticos y los valores de cría para el rendimiento y la composición de la leche, optimizando la rentabilidad de las prácticas de selección de los componentes cuya aplicación tecnológica puede ser especialmente pertinente para el sector de los productos lácteos queseros. En el octavo y noveno estudio se realizó el análisis individualizado de las curvas de lactación, con el objetivo de mejorar la eficiencia del modelo, la capacidad explicativa y el potencial de predicción cuando se trabaja con tamaños muéstrales reducidos, teniendo en cuenta que el genotipado de animales implica un costo considerable. Se utilizó el software SPSS para evaluar el rendimiento individual de 49 modelos lineales y no lineales para ajuste de la curva de lactación de 159 hembras de raza Murciano-Granadina. Se evaluó la forma de la curva de lactancia, el pico y la persistencia para cada modelo, utilizando 3107 controles de producción de leche con un promedio de 3.78 ± 2.05 lactaciones por cabra. En el octavo estudio solo se consideró la producción de leche, mientras que en el noveno se consideraron las producciones de grasa, proteína, extracto seco, lactosa y el recuento de células somáticas. En el octavo estudio los valores de mejor ajuste (R2 ajustado) (0,47) fueron alcanzados por el modelo logarítmico de 5 parámetros de Ali y Schaeffer. Todas las cabras encajaban en 38 modelos. La capacidad de ajustar diferentes formas funcionales posibles para cada cabra, que aumentó progresivamente con el número de parámetros comprendidos en cada modelo, se tradujo en una mayor sensibilidad para explicar la variabilidad individual de la forma de la curva. En el noveno estudio, los valores de mejor ajuste (R2 ajustado) (0,548, 0,374, 0,429 y 0,624 para el contenido de proteínas, grasas, materia seca y lactosa, respectivamente) fueron alcanzados mediante el modelo logarítmico de 5 parámetros de Ali y Schaeffer (ALISCH), mientras que para el recuento de células somáticas (0,481), se ajustó mejor el modelo de los tres parámetros de densidad de rendimiento parabólico (PARYLDENS). La desviación estándar de R2 ajustado entre individuos fue de alrededor de 0.2 para todos los modelos. 39 modelos se ajustaron con éxito a la curva descrita por cada cabra para todos los componentes. La complejidad paramétrica y computacional parece promover propiedades de captura de variabilidad, mientras que la flexibilidad (MSE, AIC/AICc y BIC) del modelo no mejora significativamente (P > 0,05) (predictiva y potencial explicativo). La mayoría de los modelos utilizados en el octavo y noveno estudio podrían utilizarse sólidamente para estudiar la variabilidad genética que subyace a la producción de leche, y otros rasgos de importancia económica y tal vez mejorar la evaluación de los parámetros de las curvas como criterios de selección fiables en el futuro. En el décimo trabajo, se evaluaron los efectos de los haplotipos del complejo de las caseínas en el rendimiento de la leche y sus componentes y los parámetros de la forma de la curva, utilizando inferencia bayesiana para ANOVA. Se identificaron 48 SNPs presentes en el complejo de caseína de 159 individuos no relacionados genealógicamente, portadores de 87 haplotipos. Como habían revelado los dos artículos anteriores, el modelo de ALISCH fue el mejor modelo para el rendimiento de leche (kg), proteína, grasa, materia seca y lactosa (%), mientras que para el conteo de células somáticas (SCC x103 cs/mL) se utilizó el modelo PARYLDENS. El pico y la persistencia para todos los rasgos se calcularon respectivamente. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (P < 0,05) para el rendimiento y los componentes de la leche. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas para ningún parámetro de forma de curva, excepto para el pico de porcentaje de proteína. Aquellos haplotipos para los que se encontraron mayores rendimientos de leche fueron aquellos para los que se obtuvieron porcentajes más altos de proteínas, grasas, materia seca y lactosa, mientras que la tendencia opuesta se describió para el recuento de células somáticas. En conclusión, los haplotipos del complejo de las caseínas pueden incluirse en las estrategias de selección de rasgos económicamente importantes en las cabras lecheras.

In recent years, the production of goat's milk and cheese production has increased significantly worldwide, as a result of the increase in consumption of goat milk and its derivatives. In this context, breeds such as the Murciano-Granadina and its breeders association have had to adapt to new market demands and therefore implement selection programmes focusing on the improvement of the quantity, quality and technological properties of milk. The selection of mating animals evaluating the specific connection between single nucleotide polymorphisms (SNPs) and desirable important phenotypes allows increasing farm productivity and profitability. In this sence, milk casein proteins (αS1, αS2, β, and κ) whose expression is regulated by four loci (CSN1S1, CSN1S2, CSN2, and CSN3) clustered within a region of 250 kb in the chromosome 6, comprise some of the most economically relevant traits for milk industry. Contextualy, the overarching element this doctoral thesis is the study of the implication of caseins in the productive performance of goats, both at qualitative and quantitative levels. In the first work, categorical regression equations were issued to predict which factors (genetic and nongenetic) and at which level these may determine milk yield (kg), fat (kg), protein (kg) and dry extract (kg). We studied 2090 records for milk yield, and its components from 710 Murciano-Granadina goats sorted depending on their CSN1S1 genotype. Categorical regression equations were issued to predict which and at what level these factors may determine milk yield (kg), fat (kg), protein (kg) and dry extract (kg). All environmental (farm and parturition year) and animal-inherent factors (genotype, birth type and age) resulted statistically significant (P < 0.05) except for birth season and month. CSN1S1 genotype was highly statistically significant and explained from 8.3% to 9.2% of protein and fat content variability. Heterozygote advantage of certain combinations of E allele with those alleles strongly or weakly influencing milk components and yield such as A, B, B2, F and homozygote BB genotype reported the highest statistically significant effects on milk components and yield. Our results suggest that nonparametric tests may report contextually valid results when having a large sample size is not possible. Following with CSN1S1 genes, in the second study, goats were genetically evaluated, including and excluding the αS1-CN genotype, in order to assess its repercussion on the efficiency of breeding models. Despite no significant differences being found for milk yield, fat and dry matter heritabilities, protein production heritability considerably increased after αS1-CN genotype was included in the breeding model (+0.23%). Standard errors suggest that the consideration of genotype may improve the model’s efficiency, translating into more accurate genetic parameters and breeding values (PBV). Genetic correlations ranged from -0.15 to -0.01 between protein/dry matter and milk yield/protein and fat content, while phenotypic correlations were -0.02 for milk/protein and -0.01 for milk/fat or protein content. For males, the broadest range for reliability (RAP) (0.45–0.71) was similar to that of females (0.37-0.86) when the genotype was included. PBV ranges broadened while the maximum remained similar (0.61- 0.77) for males and females (0.62–0.81) when the genotype was excluded, respectively. As seen in both studies taking into account certain CSN1S1 genotypes and including the αS1-CN genotype can increase production efficiency, milk profitability, milk yield, fat, protein and dry matter contents. For the rest of the studies 2594 milk yield and components records belonging to 159 goats from the selection nucleus and genotyped for 48 SNPs within the four genes encoding for the caseins were analysed. In the third and fourth articles, the effect of non-genetic factors on the production of milk, fat, protein, dry matter, lactose and somatic count were evaluated using Bayesian linear regression methods (third) and nonparametric methods (fourth). On both articles, the studied factors were farm, birth number, type of parturition, born-alive kids, month of parturition, season of parturition, year of parturition, control number, control type, control month, control season, control year, days in lactation, days from first control, days from last control to drying, drying month, drying season and drying year. In the third study, all studied factors significantly affected all the variables studied, either positively or negatively and from slightly to moderately as suggested by R Squared values ranging from 21.5%to 47.5%, for somatic cell counts (sc/mL) and dry matter (kg), respectively. Despite, the combinations of non-genetic factors chosen in this study may significantly condition the production of milk and its components relevantly, in the case of somatic cell counts, additional significant factors, such as disease incidence or prevalence, whose effects were not controlled may also be involved in the Murciano-Granadina goat breed. In the fourth study, all evaluated factors presented a significant influence (P < 0.0001) on all the variables studied with the exception of the number of stillbirth kids which did not significantly influence the percentage of each component and the year of drying which seemed not to significantly influence dry matter percentage. As observed in both studies, nongenetic factors affect milk yield and its compositions in the Murciano-Granadina goat breed. In addition, the inclusion of the type of milk control and parameters related to the drying season as a fixed effect in models predicting for milk yield and its composition may provide interesting information, which must be included in genetic evaluations to promote higher and better-quality milk production improving the profitability of local breeds. In the fifth work, a study of association between the additive and dominance effects of 48 SNPs found within the casein complex and milk composition and quality were studied using nonparametric tests and principal component analysis. A significant effect on milk production and quality was found for two deletions in exon 4 (CSN1S1 and CSN3), one in exon 7 (CSN2) and one in exon 15 (CSN1S2), which have been found at frequencies that range from 0.12 to 0.50. Bonferroni correction was applied to prevent the effects of multicollinerity, which may derive from the consideration of a large number of SNPs. Exons 15 and 7 were significantly associated with milk yield and components except for lactose and somatic cells, while exon 4 was significantly associated with milk yield and components except for protein and dry matter. SNPs associations with somatic cells were less frequent and weaker than those with milk yield and components. As caseins increase, somatic cells decrease, reducing milk enzymatic activity and consumption suitability. Hence, including molecular information in breeding schemes may promote production efficiency, as selecting against undesirable alleles could prevent the compromises derived from their dominance effects. In this sense, in the sixth work, the epistatic interaction among SNPs were assessed once the dominance and additive effects among the casein complex had been quantified and isolated in the previous paper,. Hence, the aims of this work were to quantify the epistatic interactions between 48 SNPs in the casein complex on the expression levels of fat, protein, dry matter, lactose and somatic cells. Given the violation of parametric assumptions, a categorical principal component analysis (CATPCA) was used as a function to limit and group the number of SNPs studied according to their relevance in terms of the explanation of variance in milk yield and components. Afterward, a nonlinear canonical correlation analysis (OVERALS) was performed to identify relationships among the SNPs clustered by CATPCA. The bidimensional solution for OVERALS explained 79.65% of the total variance in the phenotypic traits evaluated across SNP groups (57.56% of the variance for the first dimension and 42.43% for the second dimension). Out of the 48 SNPs evaluated, SNP18 was the most frequent (component loading> |0.5|, for dimension 2) and one of the most relevant when explaining intergroup epistatic variability for milk yield and components. In the seventh work, the inclusion in genetic models of casein complex SNPs additive, dominance and epistatic effect to estimate genetic parameters (heritabilities and variance components) and breeding values and their accuracies for milk yield and components were studied. Milk yield, lactose, and somatic cell count heritabilities increased considerably when the model including genetic effects was considered (0.46, 0.30, 0.43, respectively). Components standard prediction errors decreased and accuracies and reliabilities increased when genetic effects were considered. Conclusively, including genetic effects and relationships among these heritable biomarkers may improve model efficiency, genetic parameters and breeding values for milk yield and composition, optimizing selection practices profitability for components whose technological application, may be especially relevant for the cheese-making dairy sector. In the eighth and ninth works, the individualized analysis of lactation curves was performed, with the aim of improving the model's efficiency, explicative ability and predictive potential. when working with reduced sample sizes, taking into account that the genotyping of animals involves considerable cost. The SPSS software was used to evaluate the individual performance of 49 linear and nonlinear models to fit the lactation curve of 159 Murciano-Granadina does. Lactation curve shape, peak and persistence were evaluated for each model using 3107 milk yield controls with an average of 3.78 ± 2.05 lactations per goat. In the eighth study, only milk production was considered, while in the ninth the production of fat, protein, dry matter, lactose and somatic cell count were considered. In the eighth work, the best fitting values (adjusted R2) (0.47) were reached by the 5-parameter logarithmic model of Ali and Schaeffer. All the goats fit in 38 models. The ability to fit different possible functional forms for each goat, which progressively increased with the number of parameters comprised in each model, translated into a higher sensitivity to explain curve shape individual variability. In the ninth study, best fit (Adjusted R2) values (0.548, 0.374, 0.429 and 0.624 for protein, fat, dry matter and lactose content, respectively) were reached by the 5-parameter logarithmic model of Ali and Schaeffer (ALISCH), and for the three-parameter model of parabolic yielddensity (PARYLDENS) for somatic cells counts (0.481). Adj. R2 standard deviation across individuals was around 0.2 for all models. Thirty-nine models successfully fitted the curve describe by each goat for all components. Parametric and computational complexity seem to promote variability capturing properties, while model flexibility (MSE, AIC/AICc and BIC) does not significantly (P > 0.05) improve (predictive and explanatory potential). Most of the models used in the eighth and ninth studies could be used robustly to study the genetic variability underlying milk production, and other traits of economic importance and perhaps improve the evaluation of curve parameters as selection criteria. reliable in the future to meet the future challenges offered by the goat milk industry. In the tenth study, the effects of casein complex haplotypes on milk yield, milk composition and curve shape parameters were used using a Bayesian inference for ANOVA. We identified 48 single nucleotide polymorphisms (SNPs) present in the casein complex of 159 genealogically unrelated individuals, which were carriers of 87 haplotypes. Ali and Schaeffer model was chosen as the best fitting model for milk yield (kg), protein, fat, dry matter and lactose (%), while parabolic yield-density was chosen as the best fitting model for somatic cells count (SCC x103 sc/mL). Peak and persistence for all traits were computed respectively. Statistically significant differences (P < 0.05) were found for milk yield and components. However, no significant difference was found for any curve shape parameter except for protein percentage peak. Those haplotypes for which higher milk yields were reported were the ones for which higher percentages for protein, fat, dry matter and lactose, while the opposite trend was described by somatic cells counts. Conclusively, casein complex haplotypes can be considered in selection strategies for economically important traits in dairy goats.