Papel de los reguladores moleculares Fbp1 y Bmh2 en la virulencia de Fusarium oxysporum

Abstract

La rápida y específica degradación de proteínas por el sistema proteosomaubiquitina ha emergido como un importante mecanismo de regulación en eucariotas. Algunos de los procesos básicos celulares regulados por proteólisis dependiente de ubiquitina incluyen la progresión del ciclo celular, iniciación de la transcripción o transducción de señales. Las enzimas clave en el proceso de ubiquitinación son las ligasas de ubiquitina E3, puesto que son las que actúan como moduladores para el reconocimiento del sustrato y además son las que transfieren la ubiquitina activada a dicho sustrato. Las proteínas Skp1, Cul1 y la proteína F-box (SCF) son el grupo de ligasas E3 mejor conocido. Dada la importancia de dicho proceso, resultó de gran interés investigar el papel de las proteínas pertenecientes a la maquinaria de renovación proteica, en la patogénesis de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici sobre plantas de tomate. En este trabajo nos hemos centrado en el estudio de una proteína F-box, Fbp1, ortóloga de GRR1 en S. cerevisiae. Para estudiar el papel del gen fbp1 en la virulencia de F. oxysporum se ha llevado a cabo la interrupción dirigida del gen en la estirpe silvestre del hongo. La infección de plantas de tomate inoculadas con los mutantes deficientes en el gen mostró un retraso en el proceso de infección, lo que indica que Fbp1, aunque no es esencial para la patogenicidad, es necesaria para la completa virulencia de F.oxysporum. El mutante Δfbp1 presentó un retraso significativo en todas las fuentes de carbono y nitrógeno analizadas, además de un patrón de crecimiento ondulado de las hifas líder y una tinción del Spk muy abundante y deslocalizada. Mutantes de F. oxysporum en el gen fbp1 mostraron niveles reducidos de fosforilación de Fmk1 y compartían características fenotípicas con los mutantes Δ fmk1, tales como defectos en el crecimiento invasivo, en la colonización del tejido vivo de la planta y en la capacidad de fusión vegetativa. Por otro lado, los bajos niveles de fosforilación de la MAPK Mpk1 que exhibió el mutante nulo fbp1 junto con la sensibilidad a compuestos como SDS y CFW, sugieren que Fbp1 contribuye al mantenimiento de la integridad celular. Realizamos un análisis proteómico, en condiciones de crecimiento invasivo, para conocer las proteínas diferencialmente expresadas en la cepa mutante Δ fbp1 y poder así identificar posibles dianas del complejo SCFFbp1. De las 41 proteínas identificadas, 17 de ellas estaban sobre-expresadas en el mutantΔe fbp1 y relacionadas con funciones susceptibles de sufrir ubiquitinación: transporte, proteolisis, respuesta a estrés y organización de los componentes celulares...

Fast and specific degradation proteins by the ubiquitin-proteasome system have recently emerged as a major regulatory mechanism of cellular function in eukaryotes. Some basic cellular processes regulated by ubiquitin proteasome system are cell cycle, signal transduction and transcription. The key enzymes in the ubiquitination process are the E3 ubiquitin ligases, because the function as the susbtrate recognition module of the system and are capable of transferring the activated ubiquitin to the substrate. Spk1, Cul1 and F-box protein (SCF) E3 ligases are amoung the best-understood ligases. Given the importance of this process, it was of great interest investigating the role of proteins belonging to the protein turnover machinery and their contribution to Fusarium oxysporum pathogenicity. In this study, we have focused in the study of an F-box protein called Fbp1 which encodes the orthologe of S. cerevisiae GRR1 gene. In order to investigate the role Fbp1 in pathogenicity of F. oxysporum we performed a targeted disruption of fbp1 gene. Disease progression on tomato plant inoculated with Δfbp1 mutant showed reduced virulence suggesting that Fbp1 is essential for full virulence in F.oxysporum. The Δfbp1 mutant showed reduced hyphal growth on all carbon and nitrogen sources analysed. In the mutant strain, leader hyphae displayed a zig-zag growth phenotype and an abundant and delocalized staining Spk. F. oxysporum strains lacking Δ fbp1 had a reduced phosphorylation levels of Fmk1 and shared characteristic phenotypes with Δfmk1mutants, including defects in hyphal growth under nutrient-limited conditions, invasion of the underlying substrate and colonization of living plant tissue. Interestingly, low phosphorylation levels of Mpk1 and hypersensitivity to cell wall targeting compounds like CFW and SDS showed Δ fbp1 mutant, suggesting that Fbp1 contributes to cell wall integrity via a MAPK Mpk1 pathway. In order to know differentially expressed proteins in Δfbp1 mutant invasiongrowth conditions, we carried out a proteomic approach to identify the target proteins of SCFFbp1 complex. 17 of the 41 proteins differentially expressed in the present work were up-regulated in the Δfbp1 mutant and they were related with process susceptible to be ubiquininated: transport, proteolysis, response to stress and cellular component organization. One of the most abundant protein in the Δfbp1 mutant was the FOXG_0146 gene, a 14-3-3 protein annotated in the Fusarium database like Bmh2. 14-3-3 proteins are dimeric and highly conserved proteins which are involved in a many cellular...