Aproximaciones multidisciplinares incluyendo herramientas histológicas, bioquímicas y moleculares para estudiar los mecanismos de resistencia a marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum en guisante (Pisum sativum)

Abstract

Pea is a legume crop with worldwide economic importance that has been largely grown as a source of protein for animal and human nutrition for many centuries. However, yields of pea are usually reduced by biotic and abiotic stresses. Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f.sp. pisi (Fop) is one of the most destructive disease of this crop. The use of resistant cultivars is widely recognized as the safest, most economical and most effective method for controlling this disease. However, the constant evolution of the pathogen drives the necessity to broaden the genetic basis of resistance to Fop. Successful screening for disease resistance is based on (i) the availability of large and diverse germplasm collections, including wild relatives; (ii) the availability of precise and accurate screening techniques and genetic structure; (iii) the knowledge of plant and pathogen biology, variability and host–pathogen interaction. In the present work, we aimed to identify and characterize new sources of resistance to Fop within a Pisum spp. collection using different approaches and further understand mechanisms involved in resistance to this pathogen. To establish a standard, easy and useful methodology to evaluate the resistance of legumes to Fusarium oxysporum, a preliminary study evaluating the physiological and susceptibility response to the disease of two contrasting genotypes of model plant Medicago truncatula has been performed. For this we evaluated the effect of several cultural conditions known to affect the disease incidence such as plant age at inoculation, growth substrate and the method of inoculation. The results obtained indicated that the method of inoculation strongly affected fusarium wilt disease development while it was not significantly altered by the plant age or the inorganic growth substrate tested. This also allowed us to establish an optimum method of inoculation to study legume resistance to F. oxysporum that we then used to screen a Pisum spp. germplasm collection against one isolate of Fop race 2. This showed a large variation in the disease response among pea accessions ranging from highly resistant to susceptible, indicating the quantitative expression of the resistance. The repetition of the inoculation experiments on a subset of 19 accessions, indicated that the established method of inoculation and evaluation was robust and reproducible and confirmed the highly resistant phenotypes of 11 accessions. We then aimed the characterization of the mechanism of resistance responsible for the resistance in these pea accessions. First, we collected the root exudates of 12 pea accessions presenting differential responses to Fop race 2 to determine their effect on Fop growth. While the root exudates of most pea accessions stimulated Fop germination, some accessions did not and even inhibited Fop germination. This indicated that some pea accessions express some constitutive prepenetration mechanisms that might contribute to decrease or delay the building of...

El guisante es una leguminosa-grano muy importante al nivel mundial que ha sido cultivada como fuente de proteínas para la nutrición animal y humana durante muchos siglos. Sin embargo, el rendimiento del guisante se ve reducido frecuentemente debido a estreses bióticos y abióticos. La marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum f.sp. pisi (Fop) es una de las enfermedades más destructivas de este cultivo. El uso de variedades resistentes es el método más seguro, más económico y más eficaz para controlar esta enfermedad. La constante evolución del patógeno implica la necesidad de ampliar la base genética de la resistencia a Fop. El éxito en la mejora genética por resistencia se basa en (i) la disponibilidad variabilidad genética, disponible en colecciones de germoplasma, incluyendo entradas silvestres; (ii) la disponibilidad de técnicas de evaluación precisa y exacta; (iii) el conocimiento de la biología y la variabilidad de la planta y del patógeno así como de la interacción entre ambos. En el presente trabajo nos propusimos buscar y caracterizar nuevas fuentes de resistencia a Fop en una colección de germoplasma de Pisum spp. y profundizar en el conocimiento de los mecanismos implicados en la resistencia a este patógeno mediante distintas aproximaciones. Con el fin de establecer una metodología estándar, fácil y útil para evaluar la resistencia de las leguminosas frente a Fusarium oxysporum, se realizó un estudio preliminar evaluando la respuesta fisiológica y la susceptibilidad a esta enfermedad de dos genotipos contrastantes de la planta modelo Medicago truncatula. Para ello se evaluó el efecto de varias condiciones culturales conocidos por afectar la incidencia de la enfermedad tales como la edad de la planta en el momento de infección, el sustrato de crecimiento y el método de inoculación. Los resultados indicaron que el método de inoculación afecta fuertemente el desarrollo de la enfermedad mientras que la edad de la planta y los sustratos de crecimiento inorgánico probados no la afectaba significativamente. Este estudio permitió también poner a punto un método de inoculación de F. oxysporum que se utilizó posteriormente para evaluar la respuesta de una colección de germoplasma Pisum spp. frente un aislado de raza 2 de Fop. El resultado de esta evaluación mostró una gran variabilidad en la respuesta de las entradas de guisante a la enfermedad lo que indica la expresión cuantitativa de la resistencia a Fop en nuestra colección. La repetición de los experimentos con 19 entradas, indicó que el método de inoculación y de evaluación era robusto y reproducible y confirmó la alta resistencia de 11 entradas. A continuación, se persiguió la caracterización de los mecanismos responsables de la resistencia en estas entradas de guisante. En primer lugar, se recogieron los exudados radiculares de 12 entradas de guisante que presentan respuestas diferenciales a la raza 2 para determinar sus efectos sobre el crecimiento del...