Estudio de la influencia del proceso de preservación y de la centrifugación coloidal sobre la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas identificadas en el semen canino

Abstract

La preservación del semen constituye una parte fundamental dentro de los programas de reproducción asistida en perros; sin embargo, es un proceso que compromete la fertilidad potencial del mismo. En este sentido, las técnicas de selección espermática actuales nos permiten mejorar la calidad seminal tanto de eyaculados como de muestras procesadas, obteniéndose como resultado final una muestra de esperma con una mejor capacidad fecundante. La presente Tesis Doctoral se diseñó para evaluar tanto el efecto de la conservación del semen como de la selección espermática sobre la calidad seminal y las subpoblaciones cinéticas definidas en muestras espermáticas de perro. Para ello, se diseñaron cuatro estudios experimentales. En el primero se evaluó la influencia del proceso de refrigeración y de la adición de diferentes concentraciones de yema de huevo sobre la estructura subpoblacional del semen de perro. Tras definir las subpoblaciones cinéticas y el protocolo de refrigeración de elección, el segundo experimento valoró el efecto de la centrifugación en una sola capa del coloide Androcoll-C, antes y después de la refrigeración, sobre la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas del esperma canino refrigerado. En el tercer estudio se comprobó la influencia del proceso de crioconservación y de la centrifugación coloidal a través de Androcoll-C en la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas del esperma crioconservado de perro. Por último, un cuarto experimento, comparó la eficacia de las técnicas de centrifugación simple, centrifugación en una sola capa de Androcoll-C y migración vertical modificada con Androcoll-C para el procesado del semen de perro antes de su refrigeración. Durante el periodo experimental se emplearon un total de 9 perros adultos, clínicamente sanos, de diferentes razas (2 Galgos españoles, 1 Braco alemán, 1 mestizo, 4 Beagles y 1 West Highland White Terrier). Un total de 78 eyaculados fueron recolectados, 1 ó 2 veces por semana mediante manipulación digital, conservándose la fracción espermática. Según experimentos, las muestras seminales: (i) inmediatamente después de la recogida, (ii) tras la refrigeración o descongelación y (iii) después del proceso de selección espermática, fueron evaluadas para el movimiento (mediante el...

Semen preservation is an essential part in the programs of assisted reproduction in dogs; however, it is a process that damages the potential fertility of the semen sample. In this sense, the current sperm selection techniques allow us to improve semen quality in both ejaculates and processed samples, yielding the final result in a sperm sample with better fertilizing capacity. This Doctoral Thesis was designed to assess both the effect of the preservation of semen and sperm selection on sperm quality and kinetic subpopulations defined in dog sperm samples. For this purpose, four experimental studies were designed. In the first one, the cold storage process and the addition of different egg yolk concentrations on the subpopulation structure of dog semen was evaluated. Once subpopulations and the cooling protocol were defined, the second experiment evaluated the effect of single layer centrifugation with the colloid Androcoll-C before and after cooling, on sperm quality and the kinetic subpopulations structure of chilled canine sperm. In the third study the influence of cryopreservation and colloidal centrifugation through Androcoll- C in sperm quality and the kinetic subpopulations structure of cryopreserved dog semen was evaluated. Finally, a fourth experiment compared the efficacy of simple sperm washing, single layer centrifugation with Androcoll-C and vertical migration modified with Androcoll-C techniques in the preparation of dog semen before chilling. During the experimental period, a total of 9 adult dogs clinically healthy, of different breeds (two Spanish Greyhounds, one German Pointer, one Crossbreed, 4 Beagles and 1 West Highland White Terrier) were used. A total of 78 ejaculates were collected, 1 or 2 times per week by digital manipulation, preserving the sperm fraction. Depending on experiments, seminal samples (i) immediately after collection, (ii) after cooling or thawing or (iii) after sperm selection process, were evaluated for: movement (by computer-assisted semen analysis - CASA, Sperm Class Analyzer®), sperm morphology (in samples stained with Diff-Quick®), integrity of the sperm membrane (by Vital-Test® kit) and acrosome integrity (using dual staining with Propidium Iodide (PI) and fluorescein isothiocyanate-labeled peanut Arachis hypogaea aglutinin (FITCPNA) or by Spermac® staining). Finally, using a multivariate cluster analysis, sperm...