Biological control and endophytism of the olive root bacterium Pseudomonas fluorescens PICF7

Abstract

Olive (Olea europaea L.) has always been a fundamental crop in the Mediterranean Basin. Driven by the fact, among others, that an increasing number of scientific reports highlight the benefits that olive oil consumption has for human health, olive tree cultivation has spread worldwide to other regions with Mediterranean-type climate. Two relevant pathogens affecting olive trees are the hemibiotrophic soil-borne fungus Verticillium dahliae and the bacterium Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv), causal agents of Verticillium wilt of olive (VWO) and olive knot disease (OKD), respectively. Effective control of these pathogens must rely on integrated disease management strategies, with emphasis in preventive, cost-effective and environmentally-friendly measures. Among the available control tools, the use of microbial antagonists with biocontrol potential emerges as a promising strategy to implement either alone or in combination with other disease management measures. Moreover, the use of biological control agents (BCA) native from the host plant, and therefore adapted to the target ecological niche where their benefits can be deployed, is a reasonable approach. In previous studies, Pseudomonas fluorescens PICF7, an indigenous inhabitant bacterium of the olive rhizosphere, was confirmed as an effective BCA against the defoliating, highly-virulent pathotype of V. dahliae. This bacterial strain displays endophytic lifestyle in olive roots, produces the siderophore pyoverdine (Pvd), and is able to induce a broad range of defense responses in both roots and above-ground organs when colonizing olive roots. Even though the information so far gathered has increased in the last few years, the study of the PICF7- V. dahliae-olive tripartite interaction is complex and an in-depth knowledge on the relationships established among the three partners is needed. On the one hand, working with a woody, long-living plant such as olive poses difficulties inherent to the own characteristics of the plant. On the other hand, the genetic and molecular mechanisms underlying VWO biocontrol exerted by strain PICF7 are still unknown. To shed light for the first time on PICF7 traits involved in the control of V. dahliae as well as in the ability of this BCA to colonize the interior of olive roots, four PICF7 phenotypes were studied by mutant analysis. Thus, two mutants affected in traits usually related to colonization ability and biological control of plant pathogens (i.e. swimming motility and siderophore pyoverdine production) and two altered in nutritional requirements (i.e. growth delay in PDA medium and cysteine auxotrophy) were generated, characterized and evaluated in both in vitro and in in planta assays. In addition, this thesis also investigated whether the model plant Arabidopsis thaliana can be used to facilitate the identification of P. fluorescens PICF7 traits involved in both V. dahliae biocontrol and endophytic lifestyle. The aim was to compare the behavior of the same PICF7 mutant phenotypes in olive and Arabidopsis. Furthermore, since strain...

El olivo (Olea europaea L.) es un cultivo fundamental de la Cuenca Mediterránea. En estas últimas décadas se ha extendido a otras regiones que disfrutan de clima Mediterráneo debido, entre otros factores, al creciente número de investigaciones científicas que subrayan los efectos beneficiosos derivados del consumo del aceite de oliva en nuestra salud. Sin embargo, este cultivo se encuentra amenazado por diversos factores a/bióticos. De entre los diversos estreses bióticos cabe destacar al hongo hemibiotrofo de suelo Verticillium dahliae, causante de la enfermedad más importante que afecta a este cultivo, la Verticilosis del olivo (VO). Otra seria amenaza para la olivicultura es la Tuberculosis del olivo (TO) causada en este caso por la bacteria Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv). Para un control efectivo de cualquier fitopatología, entre ellas la VO y la TO, es aconsejable llevar a la práctica una estrategia basada en el manejo integrado de la enfermedad, teniendo en especial consideración aquellas medidas preventivas que son tanto rentables como respetuosas con el medio ambiente. Entre las herramientas de control disponibles, el uso de microorganismos antagonistas (agentes de control biológico [ACBs]) emerge como una medida prometedora. Los ACBs poseen la ventaja de que pueden aplicarse tanto de forma individual como en combinación con otras medidas de manejo de la enfermedad, además de actuar de manera beneficiosa en su propio nicho ecológico al cual se encuentran plenamente adaptados. En estudios previos, Pseudomonas fluorescens PICF7, bacteria indígena de la rizosfera de raíz, confirmó ser un ACB efectivo frente al patotipo defoliante, altamente virulento, de V. dahliae, además de producir el sideróforo pioverdina (Pvd), inducir un amplio rango de respuestas defensivas tanto en raíces como en órganos aéreos y comportarse como endófita en la raíz del olivo. Sin embargo, el conocimiento en lo referente a la interacción tripartita PICF7-V. dahliae-olivo es todavía muy escaso, dificultado en parte por las características propias de un huésped leñoso y longevo como el olivo. Asimismo, los mecanismos genéticos y moleculares que subyacen en el control biológico de la VO por parte de la cepa PICF7 son todavía desconocidos. Para dilucidar qué caracteres de PICF7 pueden estar implicados en el control de V. dahliae, así como la capacidad de este ACB para colonizar el interior de las raíces de olivo, se seleccionaron cuatro fenotipos de PICF7 mediante el empleo de mutantes. Para ello, se generaron, caracterizaron y evaluaron tanto in vitro como en ensayos en planta dos mutantes afectados en rasgos habitualmente relacionados con la capacidad de colonización y el control biológico de fitopatógenos (motilidad tipo ‘swimming’ y producción del sideróforo pioverdina) y dos alterados en requerimientos nutricionales (retraso en el crecimiento en medio PDA y auxotrofía en cisteína). Además, la presente tesis también investigó la posibilidad de que la planta modelo Arabidopsis thaliana...