Identification of compounds secreted by tomato roots that elicit chemotropic growth in Fusarium oxysporum

Abstract

La ruta de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) Fmk1 es la cascada de señalización mejor caracterizada en el hongo patógeno F. oxysporum, y regula varios mecanismos esenciales para la infección. Los métodos actualmente disponibles para medir el estado de activación de esta ruta son lentos y laboriosos. El primer objetivo de este trabajo ha sido el desarrollo de un método rápido y reproducible que consiste en la determinación de los niveles de transcripción de genes effectores regulados por la ruta. Estudios anteriores mostraron que el gen fpr1, que codifica una proteína secretada, muestra una expresión marcadamente reducida en mutantes de la ruta Fmk1. Hemos probado si la expression de fpr1 estaba, además, regulada por otras rutas MAPK tales como la de la integridad de la pared celular. Utilizando mutantes específicos de ambas MAPKs encontramos que tanto Fmk1 como Mpk1 contribuyen a la expresión de fpr1. Para buscar nuevos genes regulados por la ruta Fmk1 se seleccionaron diez genes descritos anteriormente como por la cascada MAPK ortóloga en S. cerevisiae. expresión reveló ninguno de esos genes candidatos se reguló diferencialmente en los mutantes de la ruta Fmk1. En conclusión, los resultados de este estudio demuestran que la regulación de los genes que funcionan aguas abajo de la ruta MAPK Fmk1 no está conservada entre F. oxysporum y S. cerevisiae. Se necesitan más estudios para identificar genes indicadores adecuados para la activación de la cascada Fmk1. Los hongos patógenos y simbiontes del suelo son capaces de dirigir el crecimiento hacia las raíces de las plantas. Actualmente se desconocen las señales que inducen la respuesta quimiotrópica. Estudios previos demostraron que las hifas de F. oxysporum muestran una respuesta quimiotrópica significativa hacia el exudado de raíces de tomate. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar los compuestos secretados por las raíces del tomate que elicitan la respuesta quimiotrópica en F. oxysporum. El fraccionamiento por exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio aniónico seguido por espectrometría de masas (LC-ESI-MS), identificaron los compuestos quimioatrayentes como peroxidasas de tipo III. Las peroxidasas de tipo III existen como familias multigénicas en todas las plantas terrestres y estan asociados a una variedad de procesos fisiológicos y de desarrollo tales como la elongación celular, la organización de la pared celular y la defensa a patógenos. La peroxidase de tipo III de rábano (horseradish peroxidase, HRP) comercial también provocó una respuesta quimiotrópica en F. oxysporum, mientras que inhibidores específicos de las peroxidasas...

The Fmk1 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is the best-characterized signaling cascade in the vascular wilt pathogen F. oxysporum and governs multiple infection-related processes. The current methods for measuring the activation status of this pathway are slow and laborious. The first objective of this work was to develop a fast and reproducible method consisting in monitoring the transcript levels of an effector gene regulated by the Fmk1 pathway. Previous studies showed that fpr1, encoding a secreted protein is drastically downregulated in mutants impaired in the Fmk1 MAPK pathway. We tested whether fpr1 expression was also regulated by additional MAPK pathways such as the cell wall integrity cascade. Using specific pathway mutants we found that both Fmk1 and Mpk1 MAPK pathways contribute to fpr1 gene expression. To search for additional genes specifically regulated by the Fmk1 pathway, we selected ten genes previously shown to be regulated by the orthologous MAPK pathway in S. cerevisiae and monitored their expression in F. oxysporum. Surprisingly, none of these candidate genes was differentially regulated in the Fmk1 pathway mutants. In conclusion, this study revealed that the regulation of genes functioning downstream of the Fmk1 MAPK pathway is not conserved between F. oxysporum and S. cerevisiae. Further studies are required to identify suitable reporter genes for monitoring Fmk1 cascade activation. Soil-inhabiting fungal pathogens and symbionts exhibit directed hyphal growth towards plant roots, but the chemoattractant signals are currently unknown. Previous studies demonstrated that germ tubes of F. oxysporum display a significant chemotropic response towards root exudates of the host plant tomato. The objective of the present work was to characterize the compounds that elicit this chemotropic response. Fractionation of tomato root exudates by size exclusion and anion-exchange chromatography followed by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) analysis, identified class III peroxidases as the chemoattractant compounds. Class III peroxidases exist as large multigene families in all land plants and have been associated with a variety of physiological and...