Functional characterization of strawberry (Fragaria × ananassa) ripening-related genes identified thoroughout a custom-made oligo-based microarray platform

Abstract

Along the development of this thesis, I have studied the transcriptomic changes that occur in the receptacle of the strawberry fruit (Fragaria × ananassa) during development and ripening using an oligo microarray platform. This analysis allowed selecting several target genes with biotechnological importance potentially involved in the process of fruit ripening, playing significant roles in various physiological processes such as hormone production, regulation of volatile compounds and cell size/shape that contribute to modulate the final organoleptic properties of the fruit. One of the selected genes (FaNCED1) showed significant homology of sequence with genes of higher plants encoding 9-cis-epoxycarotenoid dioxigenases (NCEDs), key enzymes in the production of abscisic acid (ABA). These enzymes are described as the last enzyme that acts into the plastids in the ABA biosynthetic pathway, catalyzing the cleavage of the precursor C40-xanthophylls (9-cis-neoxanthin and 9-cis-violaxanthin) to produce C25 epoxy apo-aldehyde and xanthoxin that is released into the cytosol and finally gives rise to ABA. It has been proposed that, in non-climacteric fruits such as strawberry, grape and citrus; ABA plays an important role in regulating the maturation of the fruit, much more than that undertaken by ethylene. In this work, we have observed a clear correlation between the increase in FaNCED1 gene expression and the increase of ABA content along the strawberry maturation. Furthermore, it has been found that its expression is negatively regulated by auxins synthesized in the achenes. On the other hand, I assessed the enzymatic activity of the recombinant protein FaNCED1 derived from the full-length FaNCED1 cDNA. The recombinant enzyme showed activity only in the presence of precursors in the cis configuration located one step upstream in ABA biosynthesis pathway, allowing identify, at least, one of the two products. Therefore, these results suggest that the FaNCED1 protein is related to the production of ABA. After the transient silencing of FaNCED1 gene expression, it was observed a significant reduction not only of ABA content but also of anthocyanin accumulation in the transgenic strawberry fruits, somehow slowing the entry of the fruit into ripeness stages. These findings suggest that FaNCED1 enzyme could control the ripening process through the production of this phytohormone. Taking into account these results and using our oligo microarray platform, I have studied the transcriptomic changes that occur in the receptacle of the strawberry fruit when auxin and ABA levels are reduced during development and maturation respectively. This analysis allowed selecting several target genes potentially involved in the ripening and whose expression is negatively regulated by auxins and positively regulated by ABA. One of the selected genes was a transcription factor belonging to the MYB family (FaEOBII), which is involved in regulating the production of phenylpropanoid volatiles. This R2R3 MYB TF showed significant homology of sequence with its homologue described in Petunia, PhEOBII, a flower-specific regulator of structural scent-related genes and phenylpropanoid volatiles production. Transcript levels of FaEOBII are specific and highly represented in ripe fruit receptacle and petals and correlate with eugenol content in both tissues. Furthermore, using a protein-binding microarray platform, it was determined that FaEOBII binds to MYB-binding sequences (MBS) in vitro and trans-activates in vivo promoters containing these cis-regulatory elements such as the promoter of Fragaria vesca FvCAD1 gene that encodes a key enzyme of the eugenol metabolism. Besides, transcriptome analysis of transgenic fruits with the FaEOBII expression transiently silenced indicated that only two genes involved in the metabolism of flavonoids/phenylpropanoid volatiles, eugenol synthase 2 (FaEGS2) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (FaCAD1), may be positively regulated by this TF. Also, a parallel reduction of the content of eugenol in these fruits was detected. Opposite effects were obtained when FaEOBII was overexpressed. Thus, these findings indicate that FaEOBII TF plays a key role in the production of the eugenol scent compound in strawberry fruit receptacle during ripe stage. The next gene selected to be studied was a transcription regulator belonging to the basic helix-loop-helix family (bHLH), FaPRE1, whose homologue in A. thaliana and rice is involved in regulating the size and shape of parenchymal cells of the leaves. According to its aminoacidic sequence, FaPRE1 contains a HLH domain highly conserved but lacks the basic region at the amino terminal. Based on these features, FaPRE1 can be classified into the atypical bHLH subgroup of the 32 plant bHLH subfamilies. In this work, it has been observed a correlation between the increase in FaPRE1 gene expression and the increase in the ratio length/width of strawberry fruit receptacle along development and ripening stages. Transcriptomic analysis of FaPRE1 gene expression indicate that in fruit receptacle is regulated negatively by auxins, positively by ABA and no significant changes were detected under gibberelic acid (GA3) treatments, while in vegetative tissues GA3 treatments induced an increase of FaPRE1 expression and morphological changes leading to elonganted plants. Stable transgenic plants overexpressing FaPRE1 were generated and phenotypically analyzed. Overexpression of FaPRE1 produced elongated plants as a result of an increase in the length of the aerial parts (petioles and crowns) however no significant changes were detected in the size of leaves although chlorophyll and anthocyanin content were altered in theses tissues respect to wild type plants. Also, fruit receptacles showed a greater elongation corroborated by histological analysis that showed a different size and shape of mesenchymal cells as well as a different tissue organization. Transcriptomic studies of these transgenic receptacles combined with transient silencing of FaPRE1 in fruit receptacles allowed the identification of a small group of common genes differentially regulated under both conditions respect to control fruits. Among them, it was identified a subgroup of genes that belong to cell wall functional group identified as cell wall-modifying enzymes. Besides, overexpression of FaPRE1 led to a down-regulation of two cell elongation-related genes (gene29570, ovate family protein (AOF) and gene21137, BRZ-INSENSITIVE-LONG HYPOCOTYLS 4 (BIL4)) promoting cell elongation simultaneously through two independent routes, GA and BR signalling respectively, placing putatively FaPRE1 in the middle of a crossroads between paths.

A lo largo del desarrollo de esta Tesis se han estudiado los cambios transcriptómicos que ocurren en el receptáculo del fruto de fresa (Fragaria × ananassa) durante su desarrollo y maduración usando una plataforma de microarrays de oligos. Este análisis permitió seleccionar varios genes de interés biotecnológico potencialmente implicados en el proceso de maduración, jugando papeles significativos en diversos procesos fisiológicos tales como producción hormonal, regulación de compuestos volátiles y tamaño/forma celular que contribuyen en la modulación de las propiedades organolépticas finales del fruto. Uno de los genes seleccionados (FaNCED1) mostraba homología de secuencia significativa con genes de plantas superiores que codifican 9-cis-dioxigenasas de epoxicarotenoides (NCEDs), descritas como enzimas claves en la producción de ácido abscísico (ABA). Estas enzimas han sido descritas como la última enzima que actúa en el interior de los plastidios en la ruta de biosíntesis de ABA, catalizando el corte del precursor C40-xantofilas (9-cis-neoxantina y 9-cis-violaxantina) para producir C25 epoxi apo-aldehido y xantosina que es liberada al citosol donde finalmente da lugar a ABA. Se ha propuesto que en frutos no-climatéricos como fresa, uva y cítricos, ABA juega un importante papel en la regulación de la maduración de los mismos, mucho más que el llevado a cabo por el etileno. En este trabajo, se ha observado una clara correlación entre el incremento de la expresión génica de FaNCED1 y el contenido de ABA a lo largo de la maduración de la fresa. Además, se ha encontrado que la expresión de FaNCED1 está regulada negativamente por las auxinas sintetizadas en los aquenios. Por otro lado, se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimática de la proteína recombinante FaNCED1 derivada de la secuencia completa de ADN copia de FaNCED1. La enzima recombinante mostró actividad solamente en presencia de precursores en configuración cis localizados un paso corriente arriba en la ruta de biosíntesis de ABA, permitiendo identificar, al menos, uno de los dos productos de la reacción. Por consiguiente, estos resultados sugieren que la proteína FaNCED1 está relacionada con la producción de ABA. Tras el silenciamiento transitorio de la expresión de FaNCED1, se observó una reducción significativa no sólo del contenido de ABA sino también de la acumulación de antocianinas en los frutos transgénicos generados, marcador inequívoco de la entrada en los estadios de maduración. Por tanto, de alguna manera, a través del silenciamiento de FaNCED1 se ralentizó la entrada del fruto en las etapas de maduración. Estos hallazgos sugieren que FaNCED1 podría controlar el proceso de maduración a través de la producción de la fitohormona ABA. Teniendo en cuenta estos resultados y usando una plataforma de microarrays de oligos, se estudiaron los cambios transcriptómicos que tienen lugar en el receptáculo del fruto de fresa cuando los niveles de auxinas y ABA son reducidos durante el desarrollo y la maduración, respectivamente. Este amplio análisis permitió seleccionar varios genes de interés potencialmente implicados en el proceso de desarrollo y maduración del fruto de fresa y cuya expresión presentara una regulación negativa por auxinas y positiva por ABA. Uno de los genes candidatos seleccionado fue un factor de transcripción (FT) de tipo MYB (FaEOBII), el cual está implicado en la regulación de la producción de compuestos fenilpropanoides volátiles. Este FT de tipo R2R3-MYB mostró una elevada homología de secuencia respecto a su homólogo en Petunia, PhEOBII, un regulador específico de flores de los genes estructurales relacionados con aroma y la producción de fenilpropanoides volátiles. Los niveles de transcrito de FaEOBII son elevados y altamente representados en receptáculos de fruto maduro y pétalos y se correlaciona con el contenido de eugenol en ambos tejidos. Además, usando una plataforma de microarray de unión de proteínas (protein-binding microarray platform) se determinó in vitro que FaEOBII se une a secuencias promotoras de tipo MYB (MYB-binding sequences; MBS) y que in vivo trans-activa promotores que contienen este tipo de elementos cis-reguladores como el promotor del gen FvCAD1 que codifica para una enzima clave del metabolismo del eugenol. También, el análisis transcriptómico de los frutos transgénicos generados con la expresión de FaEOBII silenciada transitoriamente indicó que sólo dos genes implicados en el metabolismo de los flavonoides/fenilpropanoides volátiles, eugenol sintasa 2 (FaEGS2) y cinamil alcohol deshidrogenasa (FaCAD1), estaban positivamente regulados por este FT. En paralelo, una reducción en el contenido de eugenol en dichos frutos fue determinada. Efectos opuestos fueron obtenidos cuando FaEOBII fue sobre-expresado. Así, estos hallazgos indican que FaEOBII juega un papel clave en la regulación de la producción de eugenol en receptáculos de fruto de fresa maduros. El siguiente gen seleccionado para su estudio fue un regulador transcripcional perteneciente a la familia de FT bHLH (basic helix-loop-helix), FaPRE1, cuyos homólogos en A. thaliana y arroz están implicados en la regulación del tamaño y la forma de las células del parénquima de las hojas. En base a su secuencia aminoacídica, FaPRE1 contiene un dominio HLH altamente conservado, pero carece de la región básica en el extremo amino. Según esto, FaPRE1 puede clasificarse dentro del subgrupo 16 de bHLH atípicos de las 32 subfamilias de bHLHs de plantas. En este trabajo se ha observado una correlación entre el incremento de la expresión de FaPRE1 y el ratio longitud/anchura del receptáculo del fruto de fresa a lo largo de las etapas de desarrollo y maduración del mismo. Análisis transcriptómicos de FaPRE1 indican que la expresión de este gen en el receptáculo está regulada negativamente por auxinas, positivamente por ABA y no presenta cambios significativos bajo tratamientos con ácido giberélico, mientras que en tejidos vegetativos de plántulas in vitro tratadas con giberelinas se indujo la expresión de FaPRE1 y se produjeron cambios morfológicos que condujeron a fenotipos elongados. Se generaron plantas transgénicas estables sobre-expresando FaPRE1 que daban lugar a plantas con fenotipos elongados como resultado de un incremento en la longitud de las zonas aéreas de la planta (peciolos y coronas), sin embargo no se detectaron cambios en el tamaño de las hojas aunque sí en el contenido de clorofila y antocianinas respecto a las plantas control. Además, estos frutos transgénicos mostraron una mayor elongación corroborada mediante análisis histológicos que revelaron diferente forma y tamaño de las células mesenquimáticas así como una organización anormal de las células de estos tejidos. Estudios transcriptómicos de estos receptáculos transgénicos en combinación con frutos con la expresión de FaPRE1 silenciada transitoriamente permitieron la identificación de un pequeño grupo común diferencialmente regulados bajo ambas condiciones respecto a frutos control. Entre ellos, se ha identificado un subgrupo de genes que pertenecen al grupo funcional de pared celular identificados como enzimas modificadoras de la pared celular. Además, la sobre-expresión de FaPRE1 condujo a la reducción de la expresión de dos genes relacionados con la elongación celular (gene29570, ovate family protein (AOF) y gene21137, BRZ-INSENSITIVE-LONG HYPOCOTYLS 4 (BIL4)), promoviendo finalmente fenotipos de elongación celular a través de dos rutas de señalización diferentes mediadas a través de giberelinas y brasinoesteroides, situando a FaPRE1 en el medio de un cruce entre dos vías independientes.