Degradación bacteriana de cianuro y compuestos nitrogenados tóxicos

Abstract

La ruta de asimilación de cianuro en P. pseudoalcaligenes CECT5344 transcurre a través de un nitrilo formado por la reacción química del cianuro con el oxalacetato, siendo este último acumulado como consecuencia de la acción conjunta de una malato:quinona oxidoreductasa (MQO) y la oxidasa terminal resistente a cianuro (CioAB) (Luque-Almagro et al., 2011b). Los nitrilos pueden ser convertidos en amonio por la acción de una nitrilasa o un sistema nitrilo hidratasa/amidasa. Con el objetivo de elucidar la ruta de asimilación de cianuro en P. pseudoalcalígenes CECT5344, se ha analizado el proteoma de este microorganismo en condiciones cianotróficas frente a nitrato como fuente de nitrógeno como control. En este estudio se identificaron proteínas relacionadas con la ruta de asimilación de cianuro en la estirpe CECT5344, que aparecían inducidas por cianuro, como NitB y NitG, cuyos genes se encuentran localizados en la agrupación génica nit1C. Además de NitB y NitG, de función desconocida, la agrupación génica nit1C codifica un regulador transcripcional del tipo Fis dependiente de σ54 (NitA), una nitrilasa (NitC), una proteína que pertenece a la superfamilia S-adenosilmetionina (NitD), un miembro de la superfamilia N-aciltransferasa (NitE), un polipéptido de la familia AIRS/GARS (NitF) y una oxidorreductasa dependiente de NADH (NitH). Un análisis transcripcional mediante RT-PCR determinó que los genes nitBCDEFGH se cotranscriben, mientras que el gen regulador nitA se transcribe de forma divergente. Además, resultados obtenidos por RT-PCR confirman que la expresión de los genes nitBCDEFGH está inducida por cianuro y reprimida por amonio. La relación entre el cianuro y el grupo de genes nit1C queda patente por el fenotipo de los mutantes deficientes nitA, nitB y nitC, incapaces de usar complejos cianuro-metálicos o 2-hidroxinitrilos como única fuente de nitrógeno. Todos estos datos indican que la nitrilasa NitC, junto con la proteína NitB, utilizan de forma específica determinados nitrilos alifáticos como sustrato, entre los que se encuentran el formado durante la asimilación de cianuro (Estepa et al., 2012). Además, entre las proteínas inducidas por cianuro se identificaron una dihidropicolinato sintasa (DapA), una fosfoserina transaminasa (SerC) y una proteína de función desconocida (Orf1), las tres codificadas por genes del operón cio, una cianasa (CynS), la proteína S6 de la subunidad ribosomal 30S (RpsF), una superóxido dismutasa (SodB), la ferritina (Dps), una oxidorreductasa (Fpr) y un factor de elongación P (EF-P). Una vez identificadas, estas proteínas se han analizado funcionalmente y se han localizado en el genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 los genes correspondientes, así como los genes adyacentes. La inducción de estas proteínas en condiciones cianotróficas sugiere que el metabolismo del cianuro incluye, además de la resistencia y asimilación de este tóxico, otros procesos biológicos relacionados con el metabolismo del cianato y de algunos aminoácidos, el estrés oxidativo y la homeostasis de hierro, entre otros. Por otra parte, el conocimiento en profundidad y la interpretación de la secuencia génica de P. pseudoalcaligenes CECT5344, así como el análisis comparativo frente a organismos no cianotrofos ha permitido entender algunos de los mecanismos implicados en la resistencia y asimilación de cianuro, lo que permitiría conducir a la posterior mejora del proceso de biodegradación de cianuro. Además, el estudio del genoma de la estirpe CECT5344 permitirá explorar la capacidad de este organismo para ser utilizado en procesos de biorremediación de residuos cianurados en los que se encuentran metales y otros tóxicos (Luque-Almagro et al., 2013; Wibberg et al., 2014). En este trabajo se muestran y discuten los resultados de la secuenciación del genoma de P. pseudoalcaligenes, así como el estudio del análisis filogenético y evolutivo de la cepa, estableciéndose de esta manera relaciones con otras especies en base a los genomas secuenciados de las mismas, entre las que destaca P. mendocina ymp relacionada con P. pseudoalcaligenes CECT5344. El estudio de las características del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 ha sido completado con un análisis comparativo frente a los genomas de otras especies de Pseudomonas, encontrándose así semejanzas y diferencias en cuanto a la distribución génica funcional. Por último, se muestra un análisis del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 en relación con los genes implicados probablemente en los procesos de asimilación de cianuro y residuos cianurados, tales como los codificantes de nitrilasas y aquellos implicados en la resistencia a cianuro como los constituyentes del operón cio que codifican la oxidasa terminal insensible a cianuro. Finalmente, se discute la presencia de genes implicados posiblemente en otros procesos con una alto potencial biotecnológico, tales como la producción de bioplásticos y la biodegradación de diversos contaminantes.

The cyanide assimilation pathway in Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 occurs through a chemical reaction of cyanide and 2-oxaloacetate to produce a cyanohydrin (2-hydroxynitrile). Cyanide causes 2-oxaloacetate accumulation in the media as consequence of the cyanide-insensitive terminal oxidase (CioAB) coupled to a malate:quinone oxidoreductase (MQO) that converts L-malate into 2-oxaloacetate. Nitriles can be converted into ammonium by the action of either a nitrilase or a nitrile hydratase/amidase system (Luque- Almagro et al., 2011b). To elucidate the cyanide assimilation pathway in P. pseudoalcaligenes CECT5344, the whole proteome of this bacterium has been analyzed under cyanotrophic conditions. In this study cyanide has been used as the sole nitrogen source for growth, a control with nitrate as an alternative nitrogen source has been also performed. Two cyanide-induced proteins of unknown function, NitB and NitG, have been identified by 2D-PAGE/MALDI-TOF/TOF. These proteins are encoded by the P. pseudoalcaligenes nit1C gene cluster that, in addition to NitB and NitG, also codes for a σ54-dependent transcriptional regulator (NitA), a nitrilase (NitC), a protein that belongs to the Sadenosylmethionine superfamily (NitD), a member of the N-acyltransferase superfamily (NitE), a polypeptide of the AIRS/GARS family (NitF), and an NADH-dependent oxidoreductase (NitH). Transcriptional RT-PCR and qPCR analyses have revealed that the nitBCDEFGH genes were co-transcribed, whereas the regulatory nitA gene was divergently transcribed. Additionally, nitBCDEFGH gene expression was induced by cyanide and repressed by ammonium. The involvement of the nit1C gene cluster in the cyanide degradation pathway of P. pseudoalcaligenes CECT5344 has been demonstrated by the phenotype of the nitA-, nitB- and nitC- mutant strains of P. pseudoalcaligenes CECT5344, which were unable to growth with sodium cyanide, cyanide-metal complexes or 2-hydroxynitriles as the sole nitrogen source. These results suggested that the nitrilase NitC, probably in association with the NitB protein, uses certain aliphatic nitriles as substrates, including the cyanihydrin formed during the cyanide assimilation pathway in P. pseudolacaligenes CECT5344 (Estepa et al., 2012). Other cyanide-induced proteins found in this proteomic study were a dihydrodipicolinate synthase (DapA), a phosphoserine transaminase (SerC) and a protein of unknown function (Orf1). The three proteins are encoded by genes located at the cio gene cluster that codes for the cyanide-insensitive respiration system. Additional proteins induced by cyanide were a cyanase (CynS), a 30S ribosomal subunit protein (RpsF), a superoxide dismutase (SodB), a ferritin (Dps), an oxidoreductase (Fpr), and a P-elongation factor (EF-P). Following protein identification, some of these proteins were functionally analysed and the genetic context of their genes studied. The induction of these proteins under cyanotrophic conditions suggests that the metabolism of cyanide in P. pseudoalcaligenes CECT5344 is based on a complex mechanism of resistance and assimilation of this toxic compound, with the involvement of other biological processes related to metabolism of cyanate and some amino acids, oxidative stress, and iron homeostasis, among others. In-depth knowledge and understanding of P. pseudoalcaligenes CECT5344 whole gene sequence as well as the comparative analysis with noncyanotrophic microorganisms has allowed to understand some of the mechanisms involved in the resistance and assimilation of cyanide, which would lead to further improvement of the cyanide biodegradation process by the strain CECT5344. The study of the genome of P. pseudoalcaligenes CECT5344 will allow exploring the ability of this microorganism to be applied in the bioremediation of cyanide wastewater containing metals and other toxic chemicals (Luque-Almagro et al., 2013; Wibberg et al., 2014). In this work, the results of the whole genome sequence of P. pseudoalcaligenes CECT5344 are shown and discussed. A phylogenetic and evolutionary analysis of the strain CECT5344 based on the whole genome sequence was performed. The comparative analysis of the genome of P. pseudoalcaligenes CECT5344 against the genomes of other Pseudomonas strains revealed similarities and differences at functional gene level. The analysis of genes involved in cyanide assimilation and resistance, such as nitrilase genes and the cio gene clusters for cyanide-insensitive respiration, is also shown. The presence of genes involved in other processes with high biotechnological potential, such as the production of polyhydroxyalkanoates and biodegradation of aromatic pollutants is also described.