Desarrollo y validación de un sistema diagnóstico rápido para la detección de alteraciones cromosómicas que provocan infertilidad en caballos basado en herramientas moleculares
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Author
Anaya, Gabriel
Director/es
Molina Alcalá, AntonioDemyda-Peyrás, S.
Publisher
Universidad de Córdoba, UCOPressDate
2017Subject
EquinosCaballo PRE
Infertilidad
Detección precoz
Anomalías cromosómicas sexuales
Diagnóstico molecular
Marcadores de tipo microsatélite
Genética animal
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El sector equino ejerce un importante impacto en la economía de España representando el 0,51% del PIB nacional. La venta de cubriciones y semen suponen uno de los principales ingresos económicos de ésta actividad por lo que, para la rentabilidad del sector, es importante que la población de reproductores presente la máxima fertilidad posible. Las anomalías cromosómicas sexuales se consideran una de las principales causas de infertilidad en la especie equina. Entre ellas destacan aquellas que afectan al par cromosómico sexual (ECAX y ECAY), especialmente el síndrome de Turner, síndrome de sexo reverso y el quimerismo celular, que pueden constituir hasta el 95% de las alteraciones en esta especie y abarcan el mayor número de casos reportados hasta la fecha. Los animales portadores de estas patologías suelen presentar una apariencia externa y comportamental normal en edades tempranas dificultando su diagnóstico. Sin embargo, tras la pubertad, comienzan a manifestar anomalías reproductivas como esterilidad o hipoplasia gonadal. Adicionalmente el elevado coste y dificultad de las técnicas clásicas para el diagnóstico de las alteraciones cromosómicas hace que muchos de los casos queden sin diagnosticar provocando que la prevalencia real quede infraestimada. Muy recientemente las técnicas de tipo molecular se han comenzado a utilizar como soporte a las técnicas citogenéticas en el diagnóstico de alteraciones de tipo cromosómico en humanos y animales de producción ganadera Entre éstas, los marcadores de tipo microsatélite (STR) han mostrado su utilidad de forma satisfactoria. Debido a esto, hemos desarrollado e implementado una nueva herramienta de diagnóstico molecular económica y sencilla que permite la detección de las principales alteraciones cromosómicas asociadas con infertilidad en caballos (CAPITULO 4). Para ello, se combinaron en un único panel diagnóstico, 6 marcadores STR en los cromosomas X (LEX026, LEX003, TKY38, TKY270 y UCDEQ502) e Y (EcaYH12) de caballo, y se añadió el análisis de la presencia o ausencia del gen SRY con el fin de caracterizar de una manera precisa éste tipo de alteraciones genéticas. Las frecuencias de los marcadores STR utilizados se caracterizaron en una población de 271 caballos de Pura Raza Español (PRE) para determinar la eficiencia del método como herramienta diagnóstica. Los resultados demostraron que todos los microsatélites son altamente polimórficos presentando un elevado número de alelos (Contenido de Información Polimórfica > 0,5). Basada en esta variabilidad se ha estimado una sensibilidad de 100% y una especificidad superior al 90% en el diagnóstico del síndrome de Turner, síndrome de sexo reverso y el quimerismo celular. Por último, el método molecular se validó utilizando para ello 10 animales con alteraciones cromosómicas previamente diagnosticados mediante técnicas citogenéticas con un 100% de eficiencia. Mediante el uso de éste panel junto con otras técnicas asociadas (citogenética clásica, citogenética molecular (FISH), test de paternidad basados en STRs, etc.) hemos descrito el primer caso a nivel mundial de un quimerismo hematopoyético 64XY/63X0 en el que una de las líneas celulares era cromosómicamente anormal (CAPITULO 2). Además, durante el desarrollo de la presente tesis, hemos diagnosticado 15 animales con quimerismo sanguíneo 64XX/64XY, demostrando que son reproductivamente normales (CAPITULOS 1 y 5), y cuatro nuevos casos de yeguas sexo reverso 64,XY SRY negativo (CAPITULO3). Este nuevo panel de marcadores moleculares podría utilizarse como herramienta complementaria en los programas de cría para determinar la presencia de individuos portadores de anomalías cromosómicas de una manera precoz lo que supondría un elevado ahorro de tiempo y esfuerzo para veterinarios y ganaderos. Horse production is an important activity with a considerable impact in the Spanish economy representing 0,51% of the GDP. Natural and artificial breeding’s are two of the most important sales of this activity, making the fertility of the individuals one of the most important traits. It is well known that genetics, and even more chromosomal abnormalities, are a well-known cause of infertility in horses. Among these pathologies, more than 95% are related to the sex chromosome pair (ECAX and ECAY), being the syndrome of Turner, syndrome of reversal sex and cellular chimerism the most reported cases to date. The animals affected commonly shows at early ages a morphology completely normal and even a reproductive behavior according with the expectance. However, the reproductive abnormalities, such as sterility or gonadal hypoplasia are being manifested after puberty. Furthermore, chromosomal abnormalities remain undiagnosed since classical diagnostic techniques employed to date are expensive and complex, producing an underestimation of the real prevalence of this kind of genetic pathologies. Molecular determination has been used as a complement of the cytogenetic techniques in the diagnostic of chromosomal alterations in humans and livestock animals. Among them, some reports showed that microsatellites (STR) could be used satisfactorily. Therefore, we developed and implemented a new, easy and cheap molecular diagnostic tool to determine the main infertility-associated chromosomal alterations in horses (CHAPTER 4). For this purpose, we combined, in a single diagnostic panel, 6 different STR markers in X (LEX026, LEX003, TKY38, TKY270 and UCDEQ502) and Y (EcaYH12) chromosomes of the horse and the determination of the presence of the SRY gene to characterize comprehensively this kind of genetic diseases. All the frequencies of the STR selected were characterized in a 271 Purebreed Spanish Horse (PRE) population to determine the efficiency of the method like a diagnostic tool. Results showed that all markers were highly polymorphic, with a sizeable number of alleles (polymorphic information content > 0.5). Based on this variability, the methodology showed 100% sensitivity and specificity higher than 90% in the detection of sex chimerism and reversal syndromes and chimerisms. Finally, the methodology was validated in individuals previously diagnosed as carriers of chromosomal abnormalities with an efficiency of 100%. Using this panel, and several extra associated techniques (classical cytogenetics, molecular cytogenetics (FISH), parentage STR-based tests, etc.) we reported the first case in the of an hematopoietic chimerism 64XY/63X0 in which one of the cellular lines was chromosomally abnormal (CHAPTER 2). Additionally, we diagnosed in this thesis 15 animals with cellular chimerism 64XX/64XY, showing that they are reproductively normal (CHAPTER 1 and 5), and four new cases of 64,XY SRY negative SDS mares, the most reported in a single breed (CHAPTER 3). Overall, this newly-developed molecular methodology could be used as a valuable complementary tool in horse breed programs to determine the presence of individuals carrying chromosomal abnormalities in early developmental stages, saving money, efforts and time to the veterinary practitioners and breeders.