Intracellular pH as a new mechanism of signal transduction

Abstract

El pH juega un papel clave en el control de la patogénesis fúngica. En el patógeno del suelo Fusarium oxysporum, causante de la marchitez vascular, el pH actúa como regulador maestro de Fmk1, una MAPK altamente conservada, esencial para el crecimiento invasivo y patogénesis en raíces de tomate. Estudios previos demostraron que el pH también regula las MAPKs Mpk1 y Hog1, de manera opuesta a Fmk1. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares de la respuesta al pH. En el presente trabajo se ha investigado, si el pH del medio afecta las rutas MAPK a través de un cambio en el pH intracelular (pHi). Se ha determinado que el pHi funciona como una señal para la regulación de las rutas MAPK en F. oxysporum. El tratamiento de las células con diethylstilbestrol (DES), un inhibidor especifico de Pma1, la principal bomba de protones de la membrana plasmática, conlleva una rápida y sostenida bajada del pHi, acompañada de una rápida y transitoria activación de las MAPKs Mpk1 y Hog1, y la inactivación de Fmk1. Esta respuesta esta conservada en la levadura panadera Saccharomyces cerevisiae, lo que indica que está conservado en hongos. Por ello se ha utilizado la levadura como modelo para investigar el mecanismo de activación de Mpk1 por acidificación del pHi. Se identificaron: una ruta alternativa de la respuesta a stress de pared, mediada por la quinasa Ypk1/2; la rama Sln1 de la ruta Hog1; y la MAPK fosfatasa Msg5 cuya abundancia es afectada por el pHi. En segundo lugar, un escrutinio realizado con mutantes knockout sensibles a ácido identificó un gran número de proteínas candidatas implicadas en la activación de Mpk1 inducida por DES. Muchos de ellos poseen ortólogos en F. oxysporum. Las funciones celulares más relevantes en este proceso son tráfico celular, homeostasis de iones (principalmente V-ATPase) y metabolismo de lípidos. Los resultados revelan que el pHi es un nuevo mecanismo de regulación de MAPKs en hongos, y sugieren que existe una compleja interacción entre rutas de señalización y funciones celulares en la regulación de este proceso.

pH is as a key player in the control of fungal pathogenicity. In the soilborne vascular wilt fungus Fusarium oxysporum, ambient pH acts as a master switch for regulation of the conserved Fmk1 MAPK cascade, essential for invasive growth and pathogenicity toward tomato roots. Previous studies indicated that pH also modulates the activity of the two other MAPKs, Mpk1 and Hog1, in an opposite way to Fmk1. The molecular events underlying the pH response are currently unknown. Here we investigated whether ambient pH modulates MAPK signaling by affecting the intracellular pH (pHi). We found that pHi acts as a signal regulating MAPK activity in F. oxysporum. Diethylstilbestrol (DES), a specific inhibitor of the plasma membrane H+-ATPase Pma1, induced a rapid and sustained decrease of pHi accompanied by rapid and transitory phosphorylation of the MAPKs Mpk1 and Hog1, and inactivation of Fmk1. Analogously, pHi also regulates MAPK signaling in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, suggesting that this mechanism is conserved in fungi. We initially investigated the mechanism of pHi-induced Mpk1 activation in the yeast model, using a candidate gene approach. Our studies revealed three potential mechanisms: an alternative branch of the canonical cell wall integrity pathway mediated by the Ypk1/2 kinase; the Sln1 branch of the Hog1 cascade; and the dual specificity MAPK phosphatase Msg5 whose abundance is affected by pHi. Moreover, a screen with a subset of acid-sensitive yeast mutants identified a number of candidates affected in DES-triggered Mpk1 activation, many of which have predicted orthologues in F. oxysporum. These candidate proteins have conserved cellular functions including cellular trafficking, ion homeostasis (mainly V-ATPase function) and lipid metabolism. Our results discover pHi as a new mechanism for MAPK signaling in fungi and reveal a complex interplay between signaling pathways and cellular functions in the regulation of this process.