Evaluación de lesiones hepáticas y respuesta inmunitaria local en ovejas vacunadas con CL1 e infectadas con Fasciola hepatica

Abstract

El objetivo del presente estudio, ha sido, por un lado evaluar la respuesta inmunitaria en hígado y nódulos linfáticos hepáticos (NLH) de ovejas no vacunada y vacunadas Catepsina L1 recombinante (rCL1) e infectadas con Fasciola hepatica durante fases tempranas de la infección. Por otro lado se evaluó la eficacia protectora de dicha vacuna según el número de parásitos adultos en fases crónicas de la infección. Para el estudio se realizaron dos experiencias, en la primera se utilizaron 44 ovejas hembras de Raza Merina de 7 meses de edad, libres de F. hepatica., que se distribuyeron en tres grupos. El grupo 1 (n=20) fueron inmunizadas con CL1 recombinante de F. hepatica (rCL1) en adyuvante Montanide ISA 70 VG. El grupo 2 (n=20) se usó como controles no vacunados e infectados, y el tercer grupo y el grupo 3 (n=4) como controles negativos no infectados ni vacunados. Los grupos 1 y 2 se infectaron oralmente con 200 metacercarias de F. hepatica. Ambos grupos a su vez se dividieron cada uno en 4 subgrupos (n=5) que fueron sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi). En la segunda experiencia se usaron 34 ovejas, hembras, de raza Merina de la misma edad, que fueron divididas en 3 grupos. El grupo 4 (n=13) estaba compuesto por animales inmunizados de igual forma que el grupo 1. El grupo 5 (n=12) correspondió a animales inmunizados sólo con el adyuvante y finalmente el grupo 6 (n=9) que fue usado como control de infección. Estos 3 grupos fueron infectados oralmente con 150 mc de F. hepatica y sacrificados a las 19 semanas post infección (spi) para valorar la carga parasitaria. Todos los grupos fueron sacrificados a las 19 semanas postinfección. Los dos experimentos fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Córdoba. El estudio parasitológico no reveló diferencias significativas en la reducción de la carga parasitaria entre los grupos 4 (vacuna CL) y los grupos 5 y 6. de la experiencia 2. El estudio patológico demostró que a los 9 dpi el grupo 1 mostraba lesiones hepáticas menos severas que el grupo 2, aunque a los 18 dpi las lesiones hepáticas eran similares en ambos grupos. Los dos grupos infectados (1 y 2) mostraron trayectos necróticos y granulomas hepáticos a los 9 y 18 dpi. La fibrosis periportal mostró un incremento progresivo en el grupo 1 y 2 a los 9 y 18 dpi, cuando fue más severa en el grupo 2 en comparación con el grupo 1. El número de células FoxP3+ en hígado aumentó significativamente en el grupo 1 y 2 a los 9 y 18 dpi en comparación con el grupo 3, sin observarse diferencias significativas entre los dos grupos infectados. En los NLH, el número de linfocitos FoxP3+ aumentó significativamente en los grupos 1 y 2 respecto al grupo 3 desde los 9 dpi, sin diferencias significativas entre los grupos 1 y 2, siendo menos numerosas en el grupo 1 a los 18 dpi. En este trabajo, se investigó la estabilidad de 10 genes de referencia candidatos en NLH e hígado. El análisis de estabilidad de la expresión génica mediante el enfoque estadístico de RefFinder reveló que PGK1, HSP90AA1 y GYPC fueron los genes más estables que podrían usarse en la normalización. El número óptimo de genes de referencia para la normalización también se calculó por geNorm usando la variación por pares (pairwise variation Vn/Vn+1) y el resultado indicó que, en ambos tejidos, el uso de dos genes más estables era suficiente para la normalización. La expresión de IL-4 aumentó a los 9 y 18 dpi y tanto en hígado como NLH de los grupos 1 y 2, en comparación con el grupo 3. La expresión de IFN-γ mostró diferentes dinámicas en hígado y NLH. En hígado aumentó a los 9 dpi en los animales del grupo 1 y a los 18 dpi aumentó en los animales del grupo 1 y 2 con respecto al grupo 3. Este incremento podría ser debido a una respuesta frente al daño hepático con formación de granulomas. En los NLH la expresión de IFN-γ disminuyó de forma gradual y significativa desde 1 dpi en adelante en los grupos 1 y 2 respecto al grupo 3, lo que sugiere que el parásito deprime la respuesta Th1 y estimula la respuesta Th2 para facilitar así su supervivencia. La expresión de TNF-α, IL-1β, FoxP3, IL-10 y TGF-β mostró un incremento en hígado y NLH de los grupos 1 y 2 a lo largo de la experiencia, particularmente a los 18 dpi. También hubo una correlación positiva significativa entre la expresión de FoxP3 e IL- 10 (por IHQ y qRT-PCR) al igual que entre la fibrosis periportal y la expresión del gen TGF-β. No hubo diferencias relevantes para la expresión de citoquinas ni de Foxp3 en hígado y NLH de los grupos 1 (vacunado con CL1) y 2 (control infectado), lo que era de esperar ya que la vacuna no indujo reducción del número de parásitos, aunque sí produjo un retraso en la llegada de las larvas al hígado reflejado por las menores lesiones a los 9 dpi en el grupo vacunado respecto al control infectado.

The aim of the present study was to evaluate the immune response during early stages of infection in the liver and hepatic lymph nodes (HLN) in unvaccinated and vaccinated with recombinant Cathepsin L1 (rCL1) sheep and challenged with Fasciola hepatica, and to evaluate the protective efficacy of the vaccine according to fluke burdens. Two experiments were carried out, in the first one fortyfour 7-month old female Merino-breed sheep obtained from a liver fluke-free farm were used to study early stages of infection. Sheep were distributed into three groups. Group 1 (n=20) was immunized subcutaneously with two doses four weeks apart with 100μg of recombinant CL1 from F. hepatica in 2 ml of Montanide ISA 70 VG. Group 2 (n=20) was used as infected control and group 3 (n=4) was used as the uninfected negative control. Groups 1 and 2 were orally infected with 200 metarcercariae of F. hepatica and divided into four subgroups each (n=5) which were sacrificed in pairs at one day post infection (dpi), 3 dpi, 9 dpi and 18 dpi. To study vaccine efficacy another 34 sheep of the same age were divided into three groups. Group 4 (n=13) were immunized as group 1; group 5 (n=12) was immunized only with the adjuvant and group 6 (n=9) was used as infected control. These 3 groups were orally infected with 150 metacercariae and were sacrificed 19 weeks post-infection for fluke burdens. The experiment was approved by the Bioethics Committee of the University of Cordoba. The parasitological study did not show significant differences of fluke burdens between group 4 and groups 5 and 6. Gross hepatic changes at 9 dpi revealed lower number of lesions in the group 1 in comparison that group 2, although at 18 dpi the liver presented similar lesions in both groups. Both infected groups (1 and 2) showed necrotic paths and hepatic granulomas at 9 and 18 dpi. Periportal fibrosis showed an increase in group 1 and 2 at 9 and 18 dpi, which it was more severe in group 2 in comparison with group 1. FoxP3+ cells showed a significant increase in liver in the groups 1 and 2 at 9 and 18 dpi in comparison with group 3. No significant differences between both infected groups were found. FoxP3+ cells had a significant increase in HLN in the groups 1 and 2 at 9 and 18 dpi. No significant differences between both infected groups were found. The stability of 10 candidate reference genes was evaluated in the HLN and liver. The stability analysis of gene expression using the RefFinder statistical approach revealed that PGK1, HSP90AA1 and GYPC were the most stable genes that could be used for normalization. The optimal number of reference genes for normalization was also calculated by GeNorm using the pairwise variation (Vn/Vn+1) and the results indicated that in both tissues the use of the two more stable genes was enough for the standarization. The expression of IL-4 increased in the liver and HLN at 9 and 18 dpi in both group 1 and 2 in comparison with group 3. The expression of IFN-γ showed different dynamics in liver and HLN. In the liver it increased at 9 dpi in animals from group 1 and at 18 dpi it increased in animals from group 1 and 2, in comparison with group 3. This increase could be due to a response to liver damage with formation of granulomas. In the HLN the expression of IFN-γ showed a significant and gradually decrease from 1 dpi onwards in both groups 1 and 2 in comparison with group 3, which suggest that the parasite downregulates the Th1 immune response and stimulates the Th2 immune response to facilitate its survival. The expression of TNF-α, IL-1β, FoxP3, IL-10 y TGF-β showed an increase in liver and HLN in groups 1 and 2 throughout the experience, particularly at 18 dpi. There was also a significant positive correlation between the expression of FoxP3 and IL-10 (by IHC and qRT-PCR) as well as between periportal fibrosis and expression of the TGF-β gene. There were no relevant differences for the expression of FoxP3 and the cytokines either in liver or HLN of group 1 (vaccinated with rCL1) or group 2 (infected control). This fact, was expected since the vaccine did not induced reduction of the number of parasites, although it caused a delay in the arrival of the larvae to the liver, reflected by the lower lesions at 9 dpi in the group 1 in comparison with group 2.