Aportaciones al conocimiento reproductivo en el caballo Pura Raza Español: fertilidad, vitrificación de esperma y monitorización de la gestación

Abstract

El caballo ha sido seleccionado atendiendo a sus éxitos deportivos más que a su tasa de fertilidad. Por ello, el caballo se ha mostrado por tener una eficiencia reproductiva más baja comparándolo con otras especies domésticas. Hay varios estudios sobre eficiencia reproductiva en diferentes razas equinas, pero no en el Pura Raza Español (PRE). Ésta, depende de factores relacionados con la yegua, el semental y factores externos. Para determinar la fertilidad equina se han desarrollado cuatro artículos. En el primer artículo, se determinaron los efectos de varios factores abióticos, como la luz, el estrés físico (pipeteo) y el shock térmico en la calidad de esperma equino fresco y refrigerado. En el experimento I, cuatro alícuotas de esperma fueron sometidas a diferentes exposiciones de luz: (i) muestra control protegida (CTRL), (ii) expuesta a luz ultravioleta a 10 cm (UV10), (iii) expuesta a luz ultravioleta a 20 cm (UV20cm) y (iv) expuesta a la luz de laboratorio (LAB). En el experimento II, cuatro alícuotas de semen fueron sometidas a pipeteo repetido durante 0, 10, 20 y 30 veces (CTRL, P10, P20, P30, respectivamente). En el experimento III, cuatro alícuotas de semen a 15°C fueron sometidas a oscilaciones térmicas: (i) esperma control refrigerado a 15°C (CTRL), (ii) oscilaciones de 1.9°C/min a temperatura de 30°C (T30), (iii) oscilaciones de 1.4°C/min, con un rápido descenso de temperatura hasta alcanzar 1.3°C (T0R) y (iv) oscilaciones de 1.1°C/min, con un descenso de temperatura lento has alcanzar 4.2°C (T0S). Los resultados revelaron que después de 30min, las muestras de esperma UV10 y UV20 mostraron significativamente (p < 0.05) los valores más bajos de motilidad total, parámetros cinemáticos y potencial mitocondrial. Después de 45 min de exposición, las diferencias fueron altamente significantes (p < 0.001). No se encontraron diferencias significativas (p > 0.05) para el pipeteo y las oscilaciones térmicas. Los resultados sugieren que, incluso si las muestras de esperma no son manejadas en el laboratorio bajo condiciones óptimas, los espermatozoides de equino en fresco o refrigerados son capaces de resistir el impacto de varios factores abióticos sin provocar una reducción de su calidad. Este estudio analiza el efecto en muestras de esperma normales, pero en el futuro la investigación podría buscar la tolerancia que las muestras de esperma equino con astenospermia tendrían a la influencia de estos factores abióticos. En el segundo artículo se llevó a cabo una investigación para evaluar el impacto de varios agentes crioprotectores (AC) y la vitrificación en la calidad del esperma. Un total de 12 eyaculados fueron sometidos a la exposición de CPA y a vitrificación. El esperma fue diluido en un rango de AC: fresco, control (BSA), sacarosa (0.15M, 0.3M y 0.5M), trehalosa (0.15M, 0.3M y 0.5M) y la combinación de sacarosa y trehalosa (M1: 0.15M sacarosa + 0.5M trehalosa; M2: 0.5M sacarosa + 0.15M trehalosa). La motilidad espermática, viabilidad, integridad del acrosoma y la fragmentación del ADN fueron evaluados en el momento de la exposición a los AC y después de la vitrificación. La exposición de los espermatozoides a varias concentraciones de sacarosa y/o trehalosa redujeron significativamente la motilidad espermática, aunque con bajas concentraciones resultaron en una motilidad más alta. La viabilidad espermática y la fragmentación del ADN no variaron después de la exposición a los AC, pero la integridad del acrosoma cayó significativamente cuando los espermatozoides fueron expuestos a AC con alta osmolaridad. Cuando los espermatozoides fueron vitrificados, los valores de motilidad fueron significativamente más altos que los obtenidos durante la exposición a AC. La concentración baja de sacarosa (0.15M y 0.3M) y trehalosa (0.15M) mostraron la mejor motilidad progresiva espermática. El procedimiento de vitrificación-calentamiento redujo significativamente la viabilidad espermática y la integridad del acrosoma, pero el ADN no varía con ninguno de los AC empleados. La vitrificación del esperma equino demuestra una baja capacidad para preservar la motilidad espermática, y los diluyentes que contienen trehalosa o sacarosa a bajas concentraciones se asocian con un mejor efecto protector en la motilidad espermática. Después de la vitrificación, el acrosoma y las membranas plasmáticas se dañaron severamente, mientras la estructura del ADN se mantuvo. El espermatozoide equino recobró la motilidad después de la vitrificación, pero se precisa realizar más estudios en la preservación de las membranas espermáticas. En el tercer artículo fueron establecidos los valores normales del espesor conjunto útero-placenta (ECUP) en yeguas Pura Raza Española (PRE) durante el último periodo de gestación. Un total de 107 yeguas fueron examinadas a los 210, 240, 270 y 300 días de gestación, de las cuales 13 tuvieron gestaciones anormales (muerte fetal, abortos o nacidos muertos). En yeguas con potros sanos, las medidas ECUP mostraron diferencias significativas (P < 0.0001) en varias edades gestacionales (4.83 ± 0.59 mm, 6.12 ± 0.60 mm, 7.41 ± 0.61 mm y 10.45 ± 0.92 mm at 210, 240, 270 y 300 días, respectivamente). Una alta correlación positiva se observó entre ECUP y la edad gestacional (r = 0.923; P < 0.001). En yeguas con gestación anormal las medidas ECUP fueron significativamente más altas (P < 0.0001) que en las gestaciones sanas en el día 270 (8.89 vs. 7.41 mm) y en el 300 (14.17 vs. 10.45 mm). La edad de la yegua, el tiempo de fecundación, el tipo de semen y la longitud de la gestación no afectan la ECUP. Los resultados obtenidos sugieren que el punto de corte para la detección anormal de las gestaciones en yeguas PRE es 7.75 mm en el día 270 y 12.7 mm en el día 300. La incidencia del aumento de ECUP en el último periodo de gestación de la yegua PRE fue del 14% y un examen ecográfico transrectal a los 270 días de gestación es muy aconsejable. La evaluación periódica placentaria podría revelar alteraciones no detectadas por los demás, permitiendo instaurar tratamiento apropiados encaminados a prevenir la pérdida fetal. Finalmente, un estudio se llevó a cabo un estudio retrospectivo para determinar la eficiencia reproductiva de la yegua PRE. Se evaluó la influencia de la edad, el estatus reproductivo, la inseminación con semen refrigerado o congelado, el número de inseminaciones por ciclo, el tipo de celo, el tipo de ovulación, la temporada reproductiva, el año de la temporada reproductiva, la presencia de fluido uterino y la edad del semental. Se incluyeron en una base de datos las inseminaciones de 122 yeguas PRE durante 4 temporadas reproductivas consecutivas (2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016). Un total de 359 ciclos fueron estudiados. Las yeguas se agruparon de acuerdo a la edad: jóvenes, mediana edad, viejas y muy viejas y de acuerdo al estatus reproductivo: vírgenes, infértiles, paridas y no cubiertas. Las tasas de gestación más altas fueron con semen refrigerado en el primer ciclo (P < 0.05), en todos los ciclos (P < 0.05), en el día 14 por temporada (P < 0.001) y en la tasa de partos (P < 0.001). Las tasas de gestación y partos fueron significativamente influenciadas por el efecto de la edad. Las yeguas jóvenes y vírgenes tuvieron las tasas de gestación más altas. No hubo diferencias significativas (P > 0.05) en la tasa de gestación en todos los ciclos cuando se analizó el número de inseminaciones por ciclo, tipo de celo, tipo de ovulación, temporada reproductiva, año de la temporada reproductiva y la edad del semental. Hubo diferencias significativas (P < 0.05) entre las yeguas que no acumularon fluido uterino (58.13%) y las que acumularon fluido intrauterino antes de la cubrición (42.35%) y después (25.00%). La yegua PRE podría ser considerada como una raza de caballo muy fértil.

Horse has been selected contemplating its sporting success more than its fertility rate. For this reason, horse has been showed to have relatively lower reproductive efficiency compared to others domestics species. There are many studies about reproductive efficiency in different breeds horses but not in Spanish Purebred (SP) horse. Equine reproductive efficiency depends on factors related to the mare, the stallion and external factors. To determine equine fertility four articles were developed. In the first article, it was determined the effects of various abiotic factors, such as light, physical stress (pipetting) and thermal shock, on the quality of fresh and cooled equine sperm. In experiment I, four sperm aliquots were subjected to different light exposures: (i) protected control samples (CTRL), (ii) exposed to UV light at 10 cm (UV10), (iii) exposed to UV light at 20 cm (UV20) and (iv) exposed to laboratory lighting (LAB). In experiment II, four semen aliquots were subjected to repeated pipetting for 0, 10, 20 and 30 times (CTRL, P10, P20 and P30, respectively). In experiment III, four semen aliquots at 15°C were subjected to thermal oscillations: (i) cooled control sperm at 15°C (CTRL), (ii) oscillations of 1.9°C/min to a temperature of 30°C (T30), (iii) oscillations of 1.4°C/min, with the temperature rapidly falling until reaching 1.3°C (T0R) and (iv) oscillations of 1.1°C/min, with the temperature slowly falling until reaching 4.2°C (T0S). The results revealed that after 30 min, UV10 and UV20 sperm samples showed significantly (p < 0.05) lower total and progressive motility values, sperm kinematic parameters and mitochondrial potential. After 45 min of exposure, differences were highly significant (p <0.001). No significant differences (p > 0.05) were found for pipetting or thermal oscillations. The results suggest that, even if equine sperm samples are not handled in the laboratory under optimal conditions, fresh and cooled equine spermatozoa are able to resist the impact of various abiotic stimuli without any reduction in their quality. This study analyses the effect on normospermic samples, but future research could look at the tolerance that asthenozoospermic equine samples have to these abiotic influences. In the second article was carried a research to evaluate the impact of various cryoprotectant agents (CPA) and vitrification on equine sperm quality. A total of 12 ejaculates were subjected to exposure to CPA and vitrification. Sperm was diluted in a range of CPA: fresh, control (BSA), sucrose (0.15M, 0.3M and 0.5M), trehalose (0.15M, 0.3M and 0.5M) and the combination of sucrose and trehalose (M1: 0.15M sucrose +0.5M trehalose; M2: 0.5M sucrose+0.15M trehalose). Sperm motility, viability, acrosome integrity and DNA fragmentation were assessed at the time of CPA exposure and after vitrification. The exposure of spermatozoa to various concentrations of sucrose and/or trehalose significantly reduced sperm motility, with lower concentrations resulting in higher sperm motility. Sperm viability and DNA fragmentation did not vary after exposure to CPA, but acrosome integrity fell significantly when spermatozoa were exposed to CPA with high osmolality. When spermatozoa were vitrified, motility values were significantly higher than those obtained during the exposure. Low concentrations of sucrose (0.15M and 0.3M) and trehalose (0.15M) showed the best progressive sperm motility. The vitrificationwarmed procedure significantly reduced sperm viability and acrosome integrity, but DNA did not vary with any of CPA used. Equine sperm vitrification demonstrates a low capacity for preserving sperm motility, and extenders containing trehalose or sucrose at lower concentrations are associated with a better protective effect on sperm motility. After vitrification, acrosome and plasma membranes were severely impaired, while the DNA structure was maintained. Equine spermatozoa partially recover the motility after vitrification, but there is a need for further studies into the preservation of sperm membranes. In the third study was established the normal values of the combined thickness of the uterus and placenta (CTUP) in Spanish Purebred mares during late pregnancy. A total of 107 mares were examined at 210, 240, 270 and 300 days of gestation, of which 13 had abnormal gestations (foetal death, abortion or stillbirth). In mares with healthy foals, CTUP measurements showed significant differences (P < 0.0001) at the various gestational ages (4.83 ± 0.59 mm, 6.12 ± 0.60 mm, 7.41 ± 0.61 mm and 10.45 ± 0.92 mm at 210, 240, 270 and 300 days, respectively). A high positive correlation was observed between CTUP and gestational age (r = 0.923; P < 0.001). In mares with abnormal gestation, CTUP measurements were significantly (P < 0.0001) higher than in healthy gestations at day 270 (8.89 vs. 7.41 mm) and day 300 (14.17 vs. 10.45 mm). The age of the mare, fertilization time, type of semen and gestation length did not affect the CTUP. The results obtained suggest that the cut-off point for detecting abnormal pregnancies in Spanish Purebred mares is 7.75 mm on day 270 and 12.7 mm on day 300. The authors find that the incidence of placental thickness enlargement in the late gestation of Spanish Purebred is 14%, and a transrectal ultrasonographic examination is highly advisable at 270 days of gestation. Such timely placental assessment could reveal otherwise undetected disorders, thereby enabling early and proper treatments to be administered to prevent foetal loss. Finally, a retrospective study was carried out to determine reproductive efficiency of Spanish Purebred (SP) mare. It was evaluated the influence of age, reproductive status, insemination with cooled or frozen semen, number of inseminations per cycle, type of oestrus, type of ovulation, breeding season, year of breeding season, presence of uterine fluid, stallions and stallion age. Records inseminations of 122 SP mares for four consecutive breeding seasons (2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016). A total of 359 cycles were studied. Mares were grouped according to age: young, middle aged, ageing and very old and to reproductive status: maiden, barren, foaling and rested. Pregnancy rates were highest with cooled semen in the first cycle (P < 0.05), all cycles (P < 0.05), day 14 pregnancies per season (P < 0.001), mares per season (P < 0.001) and foaling rate (P < 0.001). Pregnancy and foaling rates were significantly influenced by the effect of age. Young and maiden mares had highest pregnancy rates. There were not significant differences (P > 0.5) in pregnancy rate in all cycles when number of inseminations per cycle, type oestrus, type of ovulation, breeding season, year of breeding season and stallion were analyzed. There were significant differences between normal mares (58.13%) and mares with uterine fluid accumulation (P < 0.05) before breeding (42.35%) or post-breeding (25.00%). SP mares could be considered like a very fertile horse breed.