Study of the interaction between root rot oomycetes and Quercus ilex L.
Estudio de la interacción entre oomicetos de podredumbre radical y Quercus ilex L.
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Author
Ruiz Gómez, Francisco José
Director/es
Navarro Cerrillo, Rafael M.Pérez de Luque, A.
Publisher
Universidad de Córdoba, UCOPressDate
2018Subject
Forest declineMediterranean ecosystems
Dehesas
Quercus ilex
Oomycetes
Phytophthora cinnamomi
Root rot
Decaimiento forestal
Ecosistemas mediterráneos
Oomicetos
Podredumbre radicular
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Forest decline is nowadays a major challenge to management and
sustainability of natural ecosystems worldwide. This syndrome is a
multifactorial disease influenced by several biotic and abiotic agents such
as alien invasive pathogens, changes in land use and management policies,
population dynamics driven by economic and politic changes, and climatic
perturbations. All these factors changing due to anthropogenic influence,
together with others, conformed the so-called global change.
Since the 1990’s decade, the oak decline has been identified as one
of the most important ecological problems in Europe, affecting deciduous
and evergreen Quercus species from the continental forests on Central and
North Europe, to temperate forests of the Mediterranean basin. In the case
of Iberian Peninsula, holm oak (Quercus ilex L.) and cork oak (Quercus suber
L.) decline has been detected since the 1980’s decade. These two species
covered most of the forest surface of the south and central part of the
Iberian Peninsula, mainly through “dehesas” and “montados” formations.
This area is considered to be one of the worst affected regions in the world
by climate change, worsening the effects and the consequences of oak
decline in “dehesas”.
“Dehesas” are Mediterranean savanah-like ecosystems, which
provide several economic yields and ecological services. In turn, the holm
oak is the most representative tree in the Iberian Peninsula, and the main
species conforming the tree layer on the Spanish “dehesas”. The loss of this
tree layer is a major ecological and economical constraint. The holm oak
decline is mainly associated to the action of soil-borne pathogens,
especially Phytophtora cinnamomi. Despite the influence of other factors in
the decline, there is a strong association between root rot caused by
oomycetes and the death of trees. Phytophtora cinnamomi is an aggressive
alien plant pathogen widely widespread worldwide, which has been
associated with the disease, die-off and death in a large list of different plant hosts. It is able to change trophic relationships with their hosts,
becaming biotroph in asymptomatic hosts and hemibiotroph or necrotroph
in susceptible hosts. It is considered that holm oak is the most susceptible
Quercus sp. to the action of this pathogen. Additionally, other Phytophthora
spp. and Pythium spp. have been recorded associated with the holm oak
decline in Spain, Portugal, Italy and France.
Many scientific efforts have focused to study this important hostpathogen
system, obtaining great results and increasing the knowledge of
the causes and effects of the interaction, improving management
techniques to limit the spread and the symptoms. However, most of the
reviewed works are based on empirical approaches, being the underlying
mechanisms regulating the interaction between both species mostly
unknown.
This PhD Thesis covers part of this lack of basic knowledge,
focusing on the host-pathogen interaction at histological and physiological
level, and exploring the influence of the soil biota in the severity of the
disease symptoms. For this purpose, the work was structured in seven
chapters.
Chapter 1 provides the framework in which the present PhD Thesis
has been developed, and the general and specific objectives.
Chapter 2 presents the methodology developed to evaluate the
colonization and infection of Phytophthora cinnamomi in Quercus ilex
seedling through the semi-automated quantification of pathogen structures
present in histological sections of fine roots. A workflow was tuned-up
testing different fixing solutions, embedding substances and staining
methods, and the results allowed the clear differentiation of pathogen
structures from host tissues. Furthermore, different indices based on
structure location, host tissue classification and specificity of pathogen
structures were evaluated to find the easiest and statistically robust indices
that are able to explain the progress of the oomycete into the root. In chapter 3, inoculation experiments in growth chamber were
carried out to describe the pathogenesis of the Quercus ilex-Phytophthora
cinnamomi interaction. Longitudinal sections were analysed for epidermal,
cortex, parenchymatous tissue of central cylinder and vascular tissue after
1, 3, 7 and 14 days after inoculation. Total oomycete structures area,
intracellular structures area, extracellular structures area, and specific
structures area of the pathogen were quantified. The analysis of these data
results in the description of the colonization/infection cycle of the pathogen,
classified in three different stages related with their trophic behaviour.
Moreover, histological changes of the root tissues as a result of the presence
of defence responses and the action of the pathogen were described.
In Chapter 4, the differential responses of holm oak seedlings to the
inoculation with P. cinnamomi, the acute drought and combination of both
stressors were assessed. Six-months old seedlings were inoculated and
mock-inoculated, and half of each inoculation treatment plans were
subjected to acute drought meanwhile the others were well irrigated.
Photosynthesis, stomatal conductance and fluorescence were measured
weekly, and total biomass and biomass allocation parameters were
quantified at the end of the experiment. The resulting data showed
differences in the response of seedlings to drought and inoculation, and the
influence of the additive effect of both stressors in the seedlings die-off.
In Chapter 5, soil samples of “dehesas” were collected and total
DNA was extracted and analysed through metabarcoding techniques, to
evaluate the specific composition and diversity of the fungal and oomycete
communities, and to study their relationship with the disease symptoms.
The fungal community included a wide range of pathogens and abundance
of ectomycorrhizal key taxa. Phytophthora spp. dominated the oomycete
community, but the species related to root rot did not appear as the most
abundant, nor were they related directly to defoliation levels. A particular
Operational Taxonomic Unit (OTU) belonging to the genus Trichoderma
was strongly correlated with the scarcity of pathogenic Phytophthora spp. The differences in defoliation were related to changes in the functionality of
soil microbiota and diversity levels of pathogenic species.
Chapter 6 presents the general discussion of the Thesis, including
some aspects limiting the results of the works carried out, ad new work
lines deriving from this Thesis, and finally Chapter 7 contains the
conclusions of the work.
Changes in roots as a consequence of P. cinnamomi inoculation,
including defence responses, and the differential response identified with
pathogen colonization/inoculation, leads to new insights about the causes
of tree death. Holm oak responds to the attack of the pathogen, and their
physiological changes differ from the ones caused by water stress, allowing
the recovery of plants if no additional stress is present. Moreover, the study
of soil microbiome in declined “dehesas” showed the influence of the
microbial diversity in the health status of trees, and also presented new
species of oomycetes and fungi that must be considered in the management
of holm oak decline in Andalusian “dehesas”. El decaimiento forestal es hoy en día uno de los mayores desafíos
para el manejo y la sostenibilidad de los ecosistemas naturales en todo el
mundo. Dicho síndrome es una enfermedad multifactorial en la que
intervienen diversos agentes bióticos y abióticos como los patógenos
invasores, los cambios en los usos del territorio y las políticas de recursos, o
las perturbaciones climáticas. El cambio producido en todos estos factores
debido a la influencia del hombre entre otros motivos es lo que se ha dado
en llamar cambio global.
Desde la década de los 90 del siglo XX, el decaimiento de los robles
se ha identificado como uno de los problemas ecológicos más relevantes en
Europa, afectando a masas de Quercus caducifolios y perennifolios desde
los bosques continentales de Centro Europa y Norte Europa, hasta los
bosques templados de la cuenca mediterránea. En el caso de la Península
Ibérica, el decaimiento de la encina (Quercus ilex L.) y el alcornoque
(Quercus suber L.) se identificó en los años 80 del siglo XX. Estas dos
especies cubren la mayor parte de la superficie forestal del sur y centro de
la Península Ibérica, principalmente formando sistemas de dehesa y
“montados”. Dicha área geográfica está considerada como una de las
regiones a nivel mundial que se verán peor afectadas por el cambio
climático, lo que agravaría las consecuencias y los efectos del decaimiento
de la encina en las dehesas.
Las dehesas son ecosistemas mediterráneos semejantes a la sabana,
que proveen de diversos beneficios económicos y servicios ambientales. Por
su parte, la encina es el árbol más representativo de la Península Ibérica, y
la especie principal del estrato arbóreo de las dehesas. La pérdida de este
estrato es un problema ecológico y económico de gran relevancia. El
decaimiento de la encina está asociado principalmente a la acción de
patógenos de suelo, especialmente Phytophthora cinnamomi. Sin olvidar la
influencia de otros factores en el síndrome, existe una fuerte asociación entre la podredumbre radicular causada por los oomicetos y la muerte del
arbolado. Phytophthora cinnamomi es un patógeno invasor muy agresivo,
ampliamente distribuido por todo el mundo, que ha sido asociado con la
enfermedad, la decadencia y la mortalidad de una larga lista de diferentes
especies vegetales. Es una especie capaz de cambiar su relación trófica con
el huésped, comportándose como un organismo biótrofo en huéspedes
asintomáticos, y como hemibiótrofo ó necrótrofo en huéspedes
susceptibles. Se considera que la encina es la especie del género Quercus
más susceptible a la acción del patógeno. De forma adicional, otras especies
de los géneros Phytophthora y Pythium se han encontrado asociadas con el
decaimiento de la encina en España, Portugal, Italia y Francia.
Para estudiar este sistema patógeno-huésped se han llevado a cabo
grandes esfuerzos científicos, que han obtenido resultados muy meritorios
y han incrementado el conocimiento de las causas y los efectos de la
interacción, mejorando las técnicas de gestión para limitar la dispersión y
los síntomas del decaimiento. Sin embargo, la mayoría de los trabajos
revisados se basaron en aproximaciones empíricas, desconociéndose gran
parte de los mecanismos subyacentes que controlan la interacción entre las
dos especies.
Esta Tesis cubre parte de esta falta de conocimiento básico,
centrándose en la interacción entre el huésped y el patógeno a nivel
histológico y fisiológico, así como explorando la influencia de la biota del
suelo en la severidad de los síntomas de la enfermedad. Para dicho
propósito, el trabajo se estructuró en 7 capítulos.
El Capítulo 1 proporciona el marco teórico en el que se desarrolla
esta Tesis Doctoral, así como los objetivos generales y específicos.
El Capítulo 2 muestra la metodología desarrollada para evaluar la
colonización e infección de Phytophthora cinnamomi en plántulas de Quercus
ilex a través de la cuantificación semiautomática de las estructuras del
patógeno presentes en secciones histológicas de raíces finas. El flujo de
trabajo fue puesto a punto probando diferentes soluciones de fijación, sustancias de inclusión y métodos de tinción, y los resultados permitieron
la diferenciación clara de las estructuras del patógeno y de los tejidos del
huésped. Además, distintos índices basados en la localización y
especificidad de las estructuras del patógeno y en el tejido del huésped, se
evaluaron con el fin de buscar la manera más sencilla y estadísticamente
robusta de explicar el progreso del oomiceto en la raíz a través de índices.
En el capítulo 3, se llevaron a cabo experimentos en cámara de
crecimiento para describir la patogénesis de la interacción entre P.
cinnamomi y Q. ilex. Se analizaron secciones longitudinales de epidermis,
córtex, tejido parenquimático del cilindro central y tejido vascular, a los 1,
3, 7 y 14 días después de la inoculación. Se cuantificó el área total de
estructuras, estructuras intracelulares, estructuras extracelulares y
estructuras específicas del patógeno. El análisis de estos datos proporcionó
una descripción del ciclo de colonización/infección del patógeno,
clasificada en tres etapas diferentes relacionadas con su comportamiento
trófico. Asimismo se describieron los cambios histológicos resultantes de la
presencia del patógeno o de las respuestas desencadenadas por la planta.
En el capítulo 4 se analizó la respuesta diferencial de plántulas de
encina ante la inoculación con P. cinnamomi, ante la sequía severa y ante
ambos estreses combinados. Plántulas de seis meses de edad fueron
inoculados y sometidos a falsa inoculación, y la mitad de cada uno de estos
tratamientos fue sometida a sequía severa, mientras que el resto fue regada
de manera óptima. Semanalmente se midieron los valores de fotosíntesis,
conductancia estomática y fluorescencia, y la biomasa total así como la
compartimentación de la biomasa fueron cuantificadas al final del
experimento. Los datos resultantes mostraron la existencia de diferencias
en la respuesta de las plántulas ante la sequía y la inoculación, así como el
efecto aditivo de ambos estreses en la muerte de las plántulas.
En el Capítulo 5 se colectaron muestras de suelo de dehesas y se
extrajo el ADN total, que se analizó a través de técnicas de metabarcoding, con el fin de evaluar la composición específica y la diversidad de las
comunidades fúngica y de oomicetos, y para estudiar sus relaciones con los
síntomas de la enfermedad. La comunidad fúngica presentó una gran
variedad de patógenos y abundancia de taxones clave de ectomicorrizas.
Phytophthora spp. apareció como el taxón dominante dentro de la
comunidad de oomicetos, pero las principales especies relacionadas con la
podredumbre radicular no fueron las más abundantes, ni presentaron
relación directa con los niveles de defoliación. Una unidad taxonómica
operacional (OTU) particular, perteneciente al género Trichoderma, presentó
correlaciones significativas con la escasez de especies patógenas de
Phytophthora spp. Las diferencias en defoliación se correlacionaron con
cambios en la funcionalidad de la microbiota del suelo y con los niveles de
diversidad de las especies patógenas.
El Capítulo 6 presenta la discusión general de la Tesis, incluyendo
algunos aspectos que limitan los resultados de los trabajos realizados, y
nuevas líneas de trabajo que se derivan de esta Tesis, y finalmente, el
Capítulo 7 contiene las conclusiones del trabajo.
Los cambios que se producen en la raíz a consecuencia de la
inoculación con P. cinnamomi, incluyendo las respuestas defensivas, así
como la respuesta diferencial identificada con la colonización/infección,
conducen a nuevas apreciaciones sobre la causa de la muerte del arbolado.
La encina responde al ataque del patógeno, presentando variaciones en la
fisiología diferentes de las causadas por el estrés hídrico, las cuales
permiten la recuperación de las plantas si no se superpone un estrés
adicional a la inoculación. Adicionalmente, el estudio del microbioma del
suelo en dehesas con decaimiento del encinar mostró la influencia de la
diversidad microbiana en el estado sanitario del arbolado, así como mostró
nuevas especies de oomicetos y hongos que deben tenerse en consideración
en el manejo del decaimiento de las dehesas de encina en Andalucía.