Nitrogen nutrition in algae: unraveling pieces of the nitrogen assimilation puzzle and its regulation in the model alga Chlamydomonas reinhardtii
Uso del nitrógeno en algas: desvelando piezas del rompecabezas de la asimilación del nitrógeno y su regulación en el alga modelo Chlamydomonas reinhardtii
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Author
Calatrava, Victoria
Director/es
Galván Cejudo, AuroraFernández Reyes, Emilio
Publisher
Universidad de Córdoba, UCOPressDate
2018Subject
AlgaeChlamydomonas
Nitrogen metabolism
Nitrogen assimilation
Nitrate assimilaton regulatory protein (NIT2)
Molecular biology
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Las algas, formando parte de la base de la cadena trófica de ecosistemas
marinos y de agua dulce, son clave para la vida acuática. Estos organismos
fotosintéticos, sometidos a fluctuaciones constantes de disponibilidad de
nutrientes, muestran un alto nivel de adaptabilidad a estos ambientes
dinámicos. Aunque el nitrógeno (N), nutriente esencial para la vida, es
comúnmente usado por las algas en su forma inorgánica, algunas especies de
algas pueden usar compuestos de N orgánico, los cuales pueden ser
especialmente abundantes debido a la escorrentía y filtrado de áreas fertilizadas
de forma intensiva. El alga modelo Chlamydomonas reinhardtii
(Chlamydomonas) puede consumir fuentes de nitrógeno inorgánico (amonio,
nitrato y nitrito), así como L-arginina y urea. Además, este alga presenta una Laminoácido
oxidasa extracelular (LAO1) que desamina un amplio rango de
aminoácidos. En este trabajo hemos estudiado el control de la señalización que
da lugar a la preferencia de nitrato sobre N orgánico en Chlamydomonas, el
papel clave de LAO1 en el uso de aminoácidos y péptidos, así como el
establecimiento de nuevas interacciones mutualistas con bacterias que
promueven el crecimiento en N orgánico.
Capítulo 1
El factor de transcripción NIT2 es el regulador clave de los genes de la
asimilación de nitrato en Chlamydomonas. En primer lugar, comparamos el
transcriptoma de una estirpe silvestre y otra mutante nit2 de Chlamydomonas
en respuesta a nitrato. Observamos que nitrato y NIT2 reprimen los genes
involucrados en el uso de fuentes de N orgánicas, incluyendo LAO1. Mediante
el uso de mutantes de Chlamydomonas demostramos que tanto el nitrato como
el nitrito afectan negativamente el uso de aminoácidos por este alga.
Capítulo 2
Las enzimas L-aminoácido oxidasa (LAAO, L-Amino Acid Oxidase) están
ampliamente distribuidas en la naturaleza y se propone que su papel principal
en hongos y algas es la captación de nitrógeno. Mediante búsquedas
genómicas comparativas, no pudimos encontrar ningún ortólogo de LAO1 en
ningún alga verde ni en plantas, pero identificamos ortólogos en 10 de otras 27
especies de algas, incluyendo Rhodophyta, Alveolata, Heterokonta, Haptophyta
y Dinophyta. La construcción de un árbol filogenético de enzimas LAAO reveló
que las secuencias identificadas como ortólogas de LAO1 -denominadas aquí
como ALAAOs (Algal LAAOs)-, se agrupaban en la misma rama evolutiva.
Observamos que en Chlamydomonas el gen LAO1 está situado adyacente a un
gen que codifica una putativa proteína RidA, que resultó estar evolutivamente
cercana a la de cianobacterias. Nuestro análisis filogenético apoya la idea de
que las proteínas ALAAOs pueden tener un origen en el ancestro común de las
algas, el cual se originó por la endosimbiosis de una cianobacteria por un
protista. Mediante el uso de un mutante lao1 hemos mostrado que LAO1 era crucial para el crecimiento de Chlamydomonas en 16 de 20 aminoácidos
proteinogénicos, así como para algunos di-/tri-péptidos.
Además de amonio, las enzimas LAAO producen el correspondiente
cetoácido y peróxido de hidrógeno. Hemos demostrado que la reacción
espontánea de los productos derivados de la desaminación por LAO1 de Lalanina
-ácido pirúvico y peróxido de hidrógeno- genera ácido acético.
Capítulo 3
Aunque Chlamydomonas puede crecer en la mayoría de los L-aminoácidos y en
algunos di-/tri-péptidos como únicas fuentes de N, este crecimiento es mucho
menos eficiente que en fuentes de N inorgánicas, y además, algunos
aminoácidos y péptidos no pueden ser usados por este alga. De forma fortuita
descubrimos una contaminación Methylobacterium sp. que permitió el
crecimiento de Chlamydomonas en un di-péptido que no puede asimilar. Las
especies de Methylobacterium están incluidas en el grupo de bacterias
promotoras del crecimiento de plantas (PGPB, del inglés Plant Growth-
Promoting Bacteria), las cuales mejoran el crecimiento de las plantas. Tras el
muestreo en campo, aislamiento e identificación de bacterias, encontramos que
algunas especies salvajes, incluidas en los géneros Methylobacterium,
Sphingomonas, Deinococcus y Chitinophagaceae, mejoran el crecimiento de
Chlamydomonas en L-serina. Además, algunas especies de Methylobacterium
permitieron el crecimiento de Chlamydomonas en algunos aminoácidos y
péptidos que este alga no puede usar. Hemos demostrado un nuevo
mutualismo basado en un intercambio metabólico de carbono y nitrógeno entre
Chlamydomonas y M. aquaticum. Por otro lado, algunas especies de
Methylobacterium mejoraron el crecimiento de Chlamydomonas en
aminoácidos asimilables. Para esta mejora, la enzima LAO1 fue esencial para el
crecimiento del consorcio con algunas estirpes de Methylobacterium,
incluyendo M. extorquens, M. hispanicum y M. organophilum.
La comunicación química en la interacción entre organismos diferentes
media las relaciones simbióticas. Entre estas moléculas de señalización, el ácido
indolacético es una de las más estudiadas. Descubrimos que la producción de
índoles dependiente de L-triptófano por Chlamydomonas, observada aquí por
primera vez, disminuyó significativamente en el mutante lao1. Además,
observamos que altas concentraciones de ácido indolacético (> 30 μM) inhibe el
crecimiento de Chlamydomonas y que esta inhibición se puede reducir por la
presencia de especies de Methylobacterium. Algae, lying on the basis of food webs in marine and freshwater ecosystems, are
key for aquatic life. These photosynthetic organisms live under continuously
fluctuating nutrients availability, showing a high level of adaptability to these
dynamic environments. Although the essential nutrient Nitrogen (N) is usually
used by algae in its inorganic form, some algal species can use organic N
compounds, which may become especially abundant due to terrestrial leaking
and runoff of highly fertilized areas. The model alga Chlamydomonas reinhardtii
(Chlamydomonas) uptakes inorganic N sources (i.e. ammonium, nitrate and
nitrite), as well as L-arginine and urea. Moreover, this alga presents an
extracellular L-amino acid oxidase (LAO1) with a broad substrate specificity that
scavenges N from L-amino acids. In this work we studied the signaling control
that leads the preference for nitrate over organic N in Chlamydomonas, the key
role of LAO1 in the use of amino acids and peptides, as well as the establishment
of new mutualistic interactions with bacteria to facilitate growth on organic N.
Chapter 1
The transcription factor NIT2 is the key regulator of nitrate assimilation genes in
Chlamydomonas. First, we compared the transcriptome of Chlamydomonas wild
type (WT) and a nit2 mutant in response to nitrate. We observed that nitrate and
NIT2 down-regulated genes involved in organic N scavenging, including LAO1.
By the use of Chlamydomonas mutant strains we demonstrated that both nitrate
and nitrite negatively impact the use of amino acids by this alga.
Chapter 2
L-amino acid oxidase (LAAO) enzymes are widely present in nature and a major
role as N scavenger has been proposed in fungal and algal LAAOs. By
comparative genomic searches, we could not find any LAO1 ortholog in any
green plant or plant, but we identified orthologs in 10 out of 27 other algal
species, including Rhodophyta, Alveolata, Heterokonta, Haptophyta and
Dinophyta algae. The construction of a LAAO phylogenetic tree revealed that
algal protein sequences identified as LAO1 orthologs -named here as ALAAOs
(Algal LAAOs)-, clustered on the same evolutionary branch. We observed that
Chlamydomonas LAO1 gene is clustered to a putative RidA gene (LAO2), which
resulted to be closely related to cyanobacterial members. Our phylogenetic
analysis favoured the idea that ALAAOs may have a common origin in the
archaeplastidan ancestor, originated by a protist engulfing cyanobacteria. By the
use of a lao1 mutant, we showed that LAO1 was crucial for Chlamydomonas
growth on 16 out of 20 proteinogenic amino acids, as well as for some di- and
tripeptides.
Besides ammonium, LAAO produces keto acids and hydrogen peroxide.
We have demonstrated that the spontaneous reaction of the LAO1-derived
products generated by L-alanine deamination, pyruvic acid and hydrogen
peroxide, generates acetic acid. Chapter 3
Although Chlamydomonas can grow on most amino acids and some di-/tripeptides
as the sole N sources, this growth is far less efficient than that on
inorganic N, and yet, there are some amino acids and peptides that cannot be
used by this alga. We serendipitously found a contaminating Methylobacterium
sp. that allowed Chlamydomonas growth on a dipeptide that is not readily
assimilated by this alga. Methylobacterium spp. are included in the PGPB group
of bacteria (Plant Growth-Promoting Bacteria), which improve plant growth and
fitness. After field sampling, isolation and identification of some bacteria, we
found that some wild species, included in Methylobacterium, Sphingomonas,
Deinococcus, and Chitinophagaceae genera, promoted Chlamydomonas
growth on L-serine. Moreover, some Methylobacterium spp. allowed
Chlamydomonas growth on amino acids and peptides that are not used by this
alga. We have demonstrated a new mutualism based on carbon-nitrogen
metabolic exchange between Chlamydomonas and M. aquaticum. Otherwise,
some Methylobacterium spp. improved Chlamydomonas growth on assimilable
amino acids. For this growth promotion, LAO1 was crucial for consortia growth
with some Methylobacterium spp., including M. extorquens, M. hispanicum and
M. organophilum.
The chemical cross-talk between interacting organisms mediates the
beneficial and pathogenic symbiotic relationships. Within these inter-kingdom
signal molecules IAA (Indole-3-Acetic Acid) is one of the best studied. We found
that L-tryptophan-dependent indoles production in Chlamydomonas, observed
here for the first time, was significantly reduced in the lao1 mutant. Moreover,
we observed that high levels of exogenously added IAA (> 30 μM) inhibits
Chlamydomonas growth and that this inhibition may be relieved by the presence
of Methylobacterium spp.