Interacción parásito-hospedador en fasciolosis ovina: mecanismos de respuesta en fases tempranas y tardías

Abstract

Fasciola hepatica es el agente etiológico de la fasciolosis, enfermedad descrita como la principal causa de pérdidas económicas en el sector agrícola y ganadero en países desarrollados y en vías de desarrollo como consecuencia de las tasas de morbilidad y mortalidad que origina en los animales de abasto. La OMS la describe como una enfermedad parasitaria re-emergente con un especial impacto en humanos alrededor de todo el mundo. Entre los distintos principios activos disponibles para hacer frente a esta enfermedad, el triclabendazol se erigió como el fármaco de elección en el tratamiento de la fasciolosis. Debido al uso de antihelmínticos como único medio eficaz para el control de la infección, se hace necesario el estudio e implementación de vías alternativas que permitan el control de esta enfermedad, como la obtención de líneas genéticas resistentes o el desarrollo de vacunas. La infección por F. hepatica desencadena la actuación de la respuesta inmunitaria como consecuencia del reconocimiento de numerosos antígenos de excreción-secreción (FhESPs) o de la superficie del parásito. Estas moléculas han sido identificadas y purificadas con el fin de realizar ensayos vacunales con los que determinar su capacidad inmunógena y qué antígeno pudiera constituir el candidato idóneo de una vacuna eficaz. La mayoría de los estudios vacunales realizados en rumiantes se han centrado en el empleo de antígenos obtenidos a partir de la fase adulta del parásito, si bien se torna de vital importancia identificar áquellos que juegan un papel relevante durante todas las fases de la infección. Con este motivo, se empleó en un primer estudio un antígeno (rFh14- 3-3z) de la familia de proteínas 14-3-3, con el que poder determinar el perfil inmunológico y el componente parasitológico, haciendo hincapié en el número de fasciolas asentadas en hígado y la dinámica de eliminación de huevos en heces. Se usaron 24 ovejas de raza merina de seis meses de edad divididas aleatoriamente en tres grupos (n=8) con el siguiente modelo: el grupo 1 fue inmunizado con la proteína recombinante Fh14-3-3z y el adyuvante Montanide™ ISA 71 VG, el grupo 2 se inmunizó únicamente con Montanide™ ISA 71 VG (control adyuvante) y el grupo 3 fue el grupo control de infección (infectado y no vacunado). Ocho semanas posteriores a la primera inmunización los animales fueron infectados oralmente con una única dosis de 150 metacercarias. A las 6 semanas de la infección se realizó un muestreo de heces semanalmente a todos los animales para analizar la dinámica de eliminación de huevos mediante McMaster con sulfato de zinc. La presencia de huevos en heces se detectó a las 8 semanas post-infección en el grupo 1 y las 9 semanas en los grupos 2 y 3. De la misma manera, una vez sacrificados se recogieron los adultos de F. hepatica de los hígados para realizar su recuento, así como la medición de los vermes. El grupo 1 presentó una carga de 52’25 ± 16’71 fasciolas, similar al grupo 3 con una carga media de 51’13 ± 12’84 y el grupo 2 evidenció una mayor carga parasitaria con 68’13 ± 23’79 adultos. La respuesta inmunitaria humoral, para los isotipos IgG1 e IgG2, analizada mediante ELISA indirecto mostró un incremento significativo en IgG1 tres semanas después de la inmunización, mientras que IgG2 aumenta su producción significativamente únicamente después de la inmunización en el grupo 2. Debido a los ensayos que han demostrado la falta de protección en animales inmunizados con diferentes antígenos de F. hepatica y a la capacidad inmunomoduladora del parásito se hace necesario conocer la respuesta inmunitaria que se desencadena en las primeras fases de la infección. Por ello, el segundo estudio tuvo como objetivo el análisis poblacional de linfocitos (TCD4, TCD8 y WC1+γδ), macrófagos (CD14), MHCII como célula presentadora de antígenos y células dendríticas (CD83) de cavidad peritoneal de animales infectados y sacrificados en fases iniciales y tardías. En este ensayo se emplearon 37 ovejas de raza merina de seis meses de edad, las cuales fueron divididas aleatoriamente en tres grupos atendiendo al momento del sacrificio: el grupo 1 (n=20) (estadios tempranos) y grupo 2 (n=10) (estadios tardíos) fueron infectados con una dosis de 150 metacercarias. Los animales del grupo 1 fueron sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi), así mismo, el grupo 2 fueron sacrificados a las 14 semanas post-infección (spi). El grupo 3 no se infectó y se describió como grupo control negativo. Los parámetros parasitológicos del grupo 2 mostraron una carga parasitaria de 67’78 ± 13’85 adultos con una tasa de implantación con niveles de 45’19% ± 9’24. La presencia de huevos en heces se detectó a las 8 semanas de la infección, alcanzando su máximo a la semana 13. El análisis de las distintas poblaciones leucocitarias se determinó mediante citometría de flujo con distintos anticuerpos monoclonales. Los animales sacrificados en las fases tempranas únicamente mostraron un descenso significativo de los TCD4 a los 1 y 18 dpi. Asimismo, la población de CD14 peritoneal evidenció un descenso a las 9 y 18 dpi, mientras que MHCII y CD83 describen un patrón similar con una significativa disminución a los 3 y 9 dpi. Los animales sacrificados a las 14 semanas aumentaron significativamente su población de WC1+γδ pero sufrieron un descenso significativo en las subpoblaciones de macrófagos y células dendríticas peritoneales. Continuando con una mejor compresión de los mecanismos defensivos del hospedador frente a esta enfermedad, el tercer trabajo realizado tuvo como objetivo analizar la dinámica poblacional en líquido peritoneal y la producción de radicales libres en animales infectados y vacunados. Para este estudio se emplearon 45 ovejas de raza merina de seis meses de edad agrupadas aleatoriamente como se describe: el grupo 1 (n=5) fueron animales no infectados ni vacunados y fue descrito como grupo control negativo, el grupo 2 (n=20) fue experimentalmente infectado con 150 metacercarias y el grupo 3 (n=20) fue inmunizado con rFhCL1 e infectado con 150 metacercarias. El grupo 1 fue sacrificado a las 12 spi mientras que los grupos 2 y 3 fueron sacrificados a los 1, 3, 9 y 18 dpi. La respuesta inmunitaria humoral evidenció diferencias significativas en IgG1 desde las 6ª semana post-vacunación en el grupo 3 y únicamente a los 1 dpi para IgG2. El número total de leucocitos reveló un aumento significativo a los 9 y 18 dpi para el grupo 2 y 3. Más específicamente, el grupo 2 evidenció un aumento significativo de granulocitos a los 9 dpi y de las tres poblaciones peritoneales a los 18 dpi. Por su parte, el grupo 3 aumentó el número de linfocitos a los 3 y 18 dpi, así como la población de macrófagos y granulocitos a los 9 y 18 dpi. La medición de radicales libres por parte de los leucocitos se determinó mediante citometría de flujo usando 2 reactivos diferentes: DAF-2DA para el óxido nítrico y DCFH-DA para el peróxido de hidrógeno. En relación a la producción H2O2, el grupo 2 incrementó su producción por parte de los macrófagos a los 3 y 9 dpi, y a los 18 dpi por parte de los granulocitos. Asimismo, los granulocitos en el grupo 3 mostraron un aumento de este radical libre a los 9 y 18dpi. Finalmente, la producción de NO en el grupo 2 sufrió un incremento significativo por parte de los granulocitos a los 9 y 18 dpi y en los macrófagos a los 18 dpi. Sin embargo, el grupo 3 aumentó la producción de NO a los 3 dpi por parte de los macrófagos y a los 3, 9 y 18 dpi en los granulocitos.

Fasciola hepatica is the ethyological agent of fasciolosis, a disease described as the major cause of economic losses to the agricultural industry in developed and developing countries due to the high morbility and mortility rates in livestock. It has been described as a tropical reemerging disease by the WHO. Triclabendazole is the drug of choice against fasciolosis, among different drugs available for the control of the disease. Due to the use of anthelmintic as the only effective mean for the control of the infection, alternative ways for disease control are required, as genetically resistant species or the development of vaccines. Fasciola hepatica infection triggers the immune response as a consequence of the recognition of numerous excretory and secretory products (FhESPs) or tegumental proteins. These molecules have been identified and purified in order to perform vaccine trials aimed at determining their immunogenic capacity so as to develop a vaccine. Most of the vaccine trials carried out in ruminants had been conducted using the adult fluke antigens that are exposed to the immune system. Therefore, it is essential to identify the molecules that play a key role during the course of infection. On this reason, an antigen from the 14-3-3 protein family (14-3-3z) has been used in a first study. With the use of rFh14-3-3z antigen we determined the immunological and parasitological parameters since the first vaccination, with special attention to the number of adult flukes in the liver and the dynamic of faecal egg count. Twenty-four female Merino-breed sheep 6 month old were used for the study. Sheep were randomly allocated into three groups (n=8). Animals from group 1 were immunised with the recombinant antigen rFh14-3-3z in Montanide adjuvant (Montanide™ISA 71 VG -Seppic®). Group 2 was immunised with Montanide adjuvant (adjuvant control group) and animals from group 3 were not immunised and remained as positive infection control. Eight weeks after first immunisation all animals were orally challenged with a single dose of 150 metacercariae of F. hepatica. To assess egg output, faecal samples were individually collected weekly from week six after challenge until the end of the trial, and were analysed by a zinc sulphate-based flotation method using the McMaster chamber. Eggs were first detected at 8 wpi in group 1 and 9 wpi in group 2 and 3. Once sheep were slaughtered the livers were collected and the adult flukes were recovered for measurement and weighing. Fluke burden of group 1 was 52’25 ± 16’71, similar to the group 3 with a mean of 51’13 ± 12’84 adult flukes. The group 2 showed a higher fluke burden of 68’13 ± 23’79 adults. On regard to the humoral immune system, indirect ELISA showed a significant increase of IgG1 at week 3 after immunisation, while IgG2 increased significantly its values only after immunisation in group 2. Due to the failure of many vaccination trials using broad variety of F. hepatica antigens and to the immunomodulatory capacity of the liver flukes, the study of the immune response during the early stages of the infection is vital for a better understanding of the immunological pathways elicited during the host-parasite interaction. Thus, the second study was aimed at analysing the peritoneal lymphocyte (TCD4, TCD8 and WC1+γδ), macrophage (CD14), MHCII as an antigen presenting cell, and dendritic cells (CD83) populations of infected animals and slaughtered at the early and late stages of infection. Thirty-seven female Merino-breed sheep, aged 6 months, were used for the study. Animals were randomly allocated into 3 groups according to the slaughtering time: group 1 (n=20) (early stage) and group 2 (n=10) (late stage) were infected with a single dose of 150 metacercariae. Sheep from group 1 were sacrified at 1, 3, 9 and 18 days post-infection (dpi). In the same way, animals from group 2 were slaughtered at 14 weeks post-infection (spi). The group 3 was not infected and remained as a negative control group. Parasitological parameters from group 2 showed a fluke burden of 67’78 ± 13’85 adults with a implantation rate of 45’19% ± 9’24. Eggs in faecal samples were first detected at week 8 post-infection, reaching the highest figures at 13 wpi. The analysis of the different leukocyte populations was determined by flow cytometry with diverse monoclonal antibodies. Animals sacrified at the early stages of infection only showed a significant decrease of TCD4 at 1 and 18 dpi. Furthermore, CD14 peritoneal population showed a decrease at 9 and 18 dpi, while MHCII and CD83 described a similar pattern with a significant decrease at 3 and 9 dpi. Animals slaughtered at 14 wpi increase significantly WC1+γδ subpopulation but macrophage and dendritic cells peritoneal populations showed a significant decrease. Continuing with a better understanding of host immunological mechanisms against the disease, our third study aimed to analyse the dynamic of peritoneal populations and the production of free radicals in immunised and infected animals. For this study, Forty-five six-monthold male merino sheep were used and randomly allocated as described: group 1 (n=5) was not infected and not vaccinated and remained as negative control group, group 2 (n=20) was experimentally infected with 150 metacercariae and group 3 (n=20) was immunised with rFhCL1 and infected with 150 metacercariae. Group 1 was slaughtered at 12 wpi, while groups 2 and 3 were sacrified at 1, 3, 9 and 18 dpi. Humoral immune response showed significant differences in IgG1 at 6 postimmunisation in group 3 and only at 1 dpi for IgG2. Total number of leukocytes revealed a significant increase at 9 and 18 dpi for group 2 and 3. Granulocytes from group 2 increased significantly at 9 dpi and the three peritoneal populations at 18 dpi. Group 3 increased the number of lymphocytes at 3 and 18 dpi, as well as macrophage and granulocyte populations at 9 and 18 dpi. Free radical measurement was determined with flow cytometry analysis using two different reagent: DAF-2DA for nitric oxide and DCFH-DA for hydrogen peroxide. In relation to H2O2 production, macrophages from group 2 increased the production at 3 and 9 dpi, and granulocytes at 18 dpi. Finally, NO production in group 2 increased significantly in granulocytes at 9 and 18 dpi and in macrophages at 18 dpi. However, group 3 increased NO production at 3 dpi in macrophages and at 3, 9 and 18 dpi in granulocytes.