Nuevas estrategias para la criopreservación de esperma ovino mediante el uso de antioxidantes, gradientes y vitrificación

Abstract

La aplicación de la inseminación artificial (IA) en el ganado ovino no está tan extendida como en otras especies. El éxito de dicha técnica está asociada a diversos factores, entre los cuáles aquellos relacionados con la composición de los diluyentes o la técnica de preservación serán objeto de estudio en la presente tesis doctoral. Para ello, el objetivo del primer estudio que conforma esta tesis fue evaluar el impacto de la vitrificación sobre la calidad del esperma ovino, utilizando para ello diferentes agentes crioprotectores (AC) y temperaturas de almacenamiento. Se prepararon dos alícuotas, mantenidas a temperatura ambiente (22°C) y a 5°C, las cuales fueron sometidas a la exposición de AC y a vitrificación. El semen fue diluido (1:2) en medios con diferentes concentraciones de sacarosa (0.4 M, 0.6 M y 0.8 M), además de establecer un grupo control (solo con BSA). En el momento de la exposición a los AC y tras la vitrificación se evaluaron los parámetros de motilidad, morfología, funcionalidad de membrana (HOST), viabilidad, integridad del acrosoma y fragmentación del ADN espermático. La exposición de los espermatozoides a varias concentraciones de sacarosa mostró diferencias significativas, observándose valores inferiores de motilidad (total y progresiva), de morfología espermática normal y de funcionalidad de la membrana cuando se utilizaban mayores concentraciones de sacarosa, con respecto al tratamiento control. En cambio, en muestras vitrificadas, aunque la calidad espermática disminuyó drásticamente, la sacarosa ofreció una mayor motilidad total, viabilidad y funcionalidad de la membrana con respecto al control, estando esta mejora estrechamente ligada a la temperatura de almacenamiento previa a la vitrificación, con mejores resultados en muestras almacenadas a 5°C. En aras de determinar los daños sufridos por los espermatozoides durante la vitrificación, en el segundo experimento se procedió a analizar las variaciones ultraestructurales de estas células cuando eran sometidas a diferentes protocolos de criopreservación. Se prepararon alícuotas que fueron evaluadas a) tras la recolección de semen, b) tras la congelación convencional, c) tras la vitrificación de muestras mantenidas a temperatura ambiente (22°C) previo a la vitrificación, y d) tras la vitrificación de muestras mantenidas a 5°C previo a la vitrificación. Se evaluó la motilidad, la integridad del acrosoma y la fragmentación del ADN. Los cambios subcelulares fueron evaluados y descritos mediante microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido (MEB) y microscopía electrónica de transmisión (MET). Los espermatozoides mantenidos a 5°C previo a la vitrificación y diluidos con sacarosa a 0.4 M mostraron menores dimensiones para el área, longitud y anchura de la cabeza en comparación con aquellas muestras correspondientes a semen fresco, congelado y vitrificado (previamente mantenido a 22 °C). Por ello, se hipotetiza que una mayor pérdida de líquido intracelular durante la vitrificación podría prevenir daños en el espermatozoide a raíz de la reducción de la formación de cristales de hielo, aunque quizás estos efectos protectores pudieran deberse más a la reducción de cristales extracelulares como consecuencia de la modificación de las propiedades físicas tras la adición de altas concentraciones de azucares. Este es el primer estudio ultramicroscópico realizado en espermatozoides ovinos vitrificados que confirma las alteraciones funcionales del esperma detectadas previamente. Durante los procesos de criopreservación del semen, la proliferación de especies reactivas de oxigeno (EROs) produce un desequilibrio celular que deriva en daños irreversibles. Por ello, en el tercer y cuarto experimento se planteó el uso de antioxidantes, teniendo en cuenta sus efectos positivos frente a las EROs descritos por numerosos investigadores. Para ello, en el tercer estudio se evaluó el efecto de la adición de diferentes concentraciones de dos antioxidantes derivados del aceite de oliva, el hidroxitirosol (3, 4-dihidroxifenilethanol, HT) y el 3, 4- dihidroxifenilglicol (DHPG) durante el proceso de congelación-descongelación. El semen se diluyó y varias alícuotas fueron complementadas con diferentes concentraciones (10 μg/ml, 30 μg/ml, 50 μg/ml y 70 μg/ml) de HT, DHPG y una mezcla (MIX) de ambos antioxidantes. También se preparó un grupo control, sin antioxidantes. Se evaluó la motilidad, viabilidad, integridad del acrosoma, potencial de la membrana mitocondrial y la peroxidación lipídica (PL). En muestras descongeladas a las que se había añadido antioxidantes, los espermatozoides mostraron una menor PL, registrando valores similares a los espermatozoides frescos. Por el contrario, el grupo control (sin antioxidantes) mostró una PL significativamente mayor tras la descongelación. Cuando se utilizó la mezcla entre HT + DHPG (MIX), se apreció un impacto negativo sobre la integridad de la membrana de los espermatozoides y sobre la integridad del acrososoma. En el cuarto estudio se evaluó el efecto de la adición de HT, DHPG y MIX sobre el semen ovino durante su almacenamiento a 5ºC y 15ºC. Los espermatozoides se diluyeron para luego dividirlos en alícuotas suplementadas con diferentes concentraciones (5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml y 100 μg/ml) de HT, DHPG y una mezcla (MIX) de ambos antioxidantes. Se evaluó la motilidad del esperma a 0, 6, 24, 48, 72, 96 h tras la dilución del semen y posteriormente la fertilidad. La adición de antioxidantes no mejoró significativamente la motilidad total y progresiva para ambas temperaturas. Sin embargo, en las muestras almacenadas a 5ºC, los valores de LIN (48, 72, 96 h), STR (0 h) y WOB (0, 48, 72, 96 h) disminuyeron significativamente en comparación con el tratamiento control cuando se agregó una alta concentración de antioxidante (MIX100 o HT100). Por el contrario, a 15ºC, MIX50 mostró valores de VCL significativamente más altos a las 6 h que el tratamiento control. En cuanto al ensayo de inseminación artificial, aunque se apreciaron valores más altos cuando se utilizó semen suplementado con antioxidantes derivados del aceite de oliva, no se observaron diferencias significativas lo que sugiere la necesidad de desarrollar nuevos estudios. El quinto estudio se centró en evaluar el efecto de diferentes diluyentes sobre la motilidad espermática y la fertilidad durante el almacenamiento del semen a 5ºC y 15ºC utilizando para ello diluyentes de origen animal y vegetal. El semen se diluyó en tres diluyentes comerciales: Inra 96® (INRA) con base de leche desnatada, la fracción A del Biladyl® (BIL) con yema de huevo y Ovixcell® (OVIX) a base de lecitina de soja. Se evaluó la motilidad espermática a las 0, 6, 24, 48, 72 y 96 h. Para evaluar la fertilidad, se utilizaron muestras almacenadas a 15ºC diluídas en INRA y OVIX. Los resultados mostraron que la motilidad progresiva fue significativamente mayor hasta las 72 h de almacenamiento en muestras de esperma mantenidas a 5ºC en comparación con 15ºC. Cuando las muestras se almacenaron a 5ºC en OVIX, los parámetros cinemáticos como la velocidad (excepto VCL), la trayectoria (LIN, STR, WOB), ALH y BCF fueron mayores que para INRA y BIL. No se detectaron diferencias significativas en la tasa de preñez entre el INRA (62.6%) y OVIX (58.9%). Los resultados sugieren que el almacenamiento de semen a 5ºC con el diluyente OVIX es una opción interesante, ya que no se utilizan componentes de origen animal y ofrece una eficacia in vitro e in vivo similar a la de otros diluyentes de origen animal. El objetivo del sexto estudio fue analizar la eficacia de un protocolo de separación espermática de una única capa para la selección de la mejor población de espermatozoides de eyaculados frescos normales, lo que podría incrementar sus resultados tras la IA. Para este propósito, tres fracciones de esperma fueron separadas con la ayuda de la centrifugación coloidal de una sola capa (SLC). Se evaluaron la tasa de recogida espermática, la calidad y las subpoblaciones de cada fracción obtenida. Se utilizó semen de moruecos con buena calidad seminal, dividido en dos altas concentraciones espermáticas (800 y 3000 millones spz/ml, C800 y C3000, respectivamente). Tras su procesamiento mediante SLC se identificaron tres subpoblaciones diferentes en base a la motilidad espermática: SP1, rápidos y progresivos (36%); SP2, baja velocidad y sin progresividad (20,1%); y SP3, espermatozoides rápidos y no lineales, con movimiento flagelar activo (43,9%). Los resultados sugieren que la SLC no permite la separación adecuada de las poblaciones de espermatozoides cuando se utiliza en las muestras de semen de morueco de buena calidad y que contienen altas concentraciones de espermatozoides.

The application of artificial insemination (AI) in ovine is not as widespread as occur in other species. The success of the application of this technique is associated with several factors, such as extender composition or sperm preservation technique, which will be studied in the present doctoral thesis. For this purpose, the objective of this first study was to evaluate the impact of vitrification on the sperm quality using different cryoprotectant agents (CPAs) and storage temperatures. Two aliquots were prepared, maintained at room temperature (22°C) and at 5ºC, which were subjected to CPAs exposure and vitrification. The sperm was diluted (1:2) in different sucrose concentrations (0.4 M, 0.6 M and 0.8 M), as well as establishing a control group (only with BSA). Motility, morphology, membrane functionality (HOST), viability, acrosome integrity and sperm DNA fragmentation were evaluated during the sperm exposure to CPAs and after vitrification. The exposure of spermatozoa to high sucrose concentrations showed significantly lower total and progressive motility, higher morphologically abnormal spermatozoa and higher damage in sperm membrane functionality, in comparison with control treatment. On the other hand, although vitrified sperm suffered a drastic quality reduction, the adition of sucrose showed a greater total motility, viability and membrane functionality in comparison with control, being this improvement closely linked to the temperature at which the sperm had been previously maintained, showing higher values when sperm was stored at 5°C. In this sense, to determine the damage suffered by the sperm during the vitrification, in the second experiment we proceeded to analyse ultrastructural variations in ovine spermatozoa under different cryopreservation protocols. Aliquots were prepared and evaluated a) after the semen collection and pooling, b) after conventional freezing, c) after vitrification of simples maintained at room temperature (22 °C) prior to vitrification, and d) after vitrification of samples maintained at 5°C prior to vitrification. We assessed motility, acrosome integrity and DNA fragmentation. Subcellular sperm changes were assessed and described by light microscopy, scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). The maintenance of spermatozoa at 5°C prior to vitrification and the use of 0.4M sucrose pointed out lower dimensions of area, length and width than fresh, frozen and vitrified sperm (maintained at 22°C prior to vitrification). Therefore, it could be hypothesized that greater intracellular fluid loss during vitrification could prevent damages in the spermatozoon throughout the reduced ice crystals formation, but mainly by the reduction of extracellular ice crystals due to the physical properties modification obtained when high concentrations of sugars are added. This is the first ultramicroscopic study carried out in ovine vitrified spermatozoa, which confirms the functional sperm alterations previously detected. During sperm cryopreservation processes, the proliferation of reactive oxygen species (ROS) produces a cellular imbalance that leads to irreversible damage. Therefore, the use of olive oil derived antioxidants were evaluated in the third and fourth experiments. The third study assessed the effect of the addition of hydroxytyrosol (3, 4-dihidroxifenilethanol, HT) and 3, 4- dihidroxifenilglicol (DHPG) during the freezing-thawing process. The semen was diluted and aliquots were supplemented with different concentrations (10 μg/ml, 30 μg/ml, 50 μg/ml and 70 μg/ml) of HT, DHPG and a mixture (MIX) of both antioxidants. A control group without antioxidants was also prepared. Motility, viability, acrosome integrity, mitocondrial membrane potential and lipid peroxidation (LPO) were evaluated. When antioxidants were added, thawed spermatozoa exhibited relatively low LPO, recording values similar to fresh spermatozoa; by contrast, the control group of frozen-thawed spermatozoa without antioxidants exhibited significantly higher LPO. The addition of a HT+DHPG mixture (MIX) had a negative impact on sperm membrane and acrosome integrity The fourth study evaluated the effect of the addition of HT, DHPG and MIX on ram sperm during storage at 5ºC and 15ºC. The spermatozoa were diluted and then divided into aliquots supplemented with different concentrations (5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml and 100 μg/ml) of HT, DHPG and a mixture (MIX) of both antioxidants. Sperm motility was evaluated at 0, 6, 24, 48, 72, 96 h after dilution of semen, and fertility was also determined. The addition of antioxidants did not significantly improve the total and progressive motility for both temperatures. However, in samples stored at 5ºC, LIN (48, 72, 96 h), STR (0 h) and WOB (0, 48, 72, 96 h) values significantly decreased in comparison with control group when high antioxidant concentrations were added (MIX100 or HT100). By contrast, spermatozoa maintained at 15ºC and supplemented with MIX50 showed significantly higher VCL values at 6 h than the control group. According to the artificial insemination trial, no significant differences were observed when antioxidant were added in the semen extender, although higher fertility values were observed when semen was treated with antioxidants, suggesting further studies. The fifth study evaluated the effects of different extenders on sperm motility and fertility during storage of semen at 5ºC and 15ºC using animal and plant origin diluents. Semen was diluted in three commercial extenders: Inra 96® (INRA) based on skimmed milk; Biladyl® A fraction (BIL) based on egg yolk; and Ovixcell® (OVIX) based on soybean lecithin. Sperm motility was assessed at 0, 6, 24, 48, 72 and 96 h. In order to evaluate fertility, samples stored at 15ºC were used after dilution in INRA and OVIX. Results showed that progressive motility was significantly higher up to 72 h of storage in sperm samples maintained at 5ºC in comparison with 15ºC, similar in each tested diluent. When samples were stored at 5ºC in OVIX, kinematic parameters as velocity (except VCL), trajectory (LIN, STR, WOB), ALH and BCF were higher than in INRA and BIL. No significant differences for pregnancy rate were detected between INRA (62.6%) and OVIX (58.9%). The results suggested that the storage of semen at 5ºC with OVIX extender is an interesting option since non-animal components are used and offers similar in vitro and in vivo efficiency than other extenders containing animal components. The objective of the sixth study was analyse the efficiency of a one-layer protocol for sperm separation to select the best sperm population in fresh, normospermic ram ejaculates, which might increase the AI results. For this purpose, three fractions of sperm were separated by single layer colloidal centrifugation (SLC). We assessed the rate of sperm collection, quality and subpopulations of each obtained fraction. Semen from normospermic ram, containing two high sperm concentrations (800 and 3000 million sperm/ml, C800 and C3000, respectively) were processed by SLC. Based on the sperm motility, three different subpopulations were identified: SP1, rapid and progressive (36%); SP2, low velocity and no progressivity (20.1%); and SP3, rapid and nonlinear spermatozoa, with active flagellar movement (43.9%). Results suggest that SLC does not allow adequate separation of sperm populations when used on normospermic ram sperm samples containing high sperm concentrations.