Estrategias moleculares para la identificación de genes implicados en el control de caracteres agronómicos en garbanzo (Cicer arietinum L.)

Abstract

El garbanzo (Cicer arietinum L.) es la segunda leguminosa de grano más cultivada en el mundo. Las principales enfermedades que afectan a este cultivo son el fusarium y la rabia. Tradicionalmente el método más eficaz para controlar estas enfermedades ha sido el desarrollo de cultivares resistentes para estabilizar los rendimientos del cultivo. Desde que se demostró que las plantas tenían sexo, en los programas de mejora vegetal se incluye la realización de cruzamientos para la obtención de individuos con nuevas combinaciones de genes. En el capítulo I de esta tesis se muestra un estudio de programas de cruzamientos y el uso de marcadores moleculares STMS (Sequence Tagged Microsatellite Site) para evaluar la naturaleza híbrida de las F1 obtenidas. Estos marcadores resultaron ser una valiosa herramienta para la detección de híbridos, ya que son fáciles de visualizar y tienen un bajo coste. Fusarium en garbanzo está causada por el hongo del suelo Fusarium oxysporum. sp. Ciceris (Foc), siendo la raza 5 (Foc5) la más importante en la Cuenca Mediterránea. En el capítulo II, ha sido posible delimitar a 820 kb el área relacionada con la resistencia a Foc5 en el cromosoma 2 de garbanzo. Para ello se han analizado marcadores STMS, marcadores específicos de genes y SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), ubicados en la región interés, en RILs (líneas recombinantes) y NILs (líneas casi isogénicas). En esta región del genoma hay 26 genes, entre ellos una proteína quinasa (LOC101511605) que podría considerarse un gen candidato por su posible implicación en reacciones de resistencia. En el mismo estudio, se analizó una colección de 32 genotipos que diferían en su reacción a Foc5 utilizando marcadores SNPs. El análisis de estos marcadores con métodos de agrupamiento mostró cuatro grupos principales de genotipos, tres de ellos agruparon los genotipos resistentes y el cuarto los genotipos susceptibles. Seis de los SNPs utilizados en este estudio mostraron el mismo patrón entre las líneas resistentes y diferente de las susceptibles, por lo que podrían ser interesantes para su uso en selección asistida por marcadores. Continuando con este contexto, en el capítulo III, utilizando una pareja de NILs que difiere en su reacción a Foc5, se realizaron estudios de expresión de los genes candidatos con PCR cuantitativa en tiempo real. Los resultados mostraron que la NIL resistente indujo un grupo de genes a las 24 horas después de la inoculación, mientras que la NIL susceptible indujo un segundo grupo de genes, diferentes a los inducidos por la línea resistente, a las 48 horas. En el último capítulo (IV) se ha identificado y caracterizado el gen implicado en el control del carácter simple/doble vaina. El garbanzo normalmente tiene una flor por nudo, pero se han descrito mutantes con dos o más flores, característica interesante desde el punto de vista agronómico. En estudios previos, la mutación doble vaina del genotipo JG62 (doble vaina) se localizó en el cromosoma 6 en una región de 92,6 kb con 7 genes, señalando a CaRAX2-like por su función como principal candidato en el control de este carácter. En este trabajo se ha identificado una deleción de 44 kb en JG62 que incluye, entre otros, a CaRAX2-like, este alelo se ha denominado sfl-d1. Por otro lado, utilizando líneas doble vaina procedentes de una colección del USDA se ha encontrado un nuevo alelo para doble vaina en el mismo locus con una mutación puntual en CaRAX2-like, denominado sfl-d2. Se ha realizado una caracterización funcional mediante microscopía SEM e hibridación in situ y se ha utilizado diferente material vegetal para realizar cruzamientos controlados. Todo esto nos ha permitido confirmar a CaRAX2 como el gen que controla el carácter simple/doble vaina en garbanzo.

Chickpea (Cicer arietinum L.) is the second most important cultivated grain legume in the world in terms of cultivated area. The most important diseases affecting this crop are fusarium wilt and ascochyta blight. The development of resistant cultivars is the most effective method of managing these diseases and stabilizing chickpea yields. Since it was shown that plants had sex, the use of crosses were included in breeding programs to obtain individuals with new combinations of genes. Chapter I of this thesis shows a study about the use of STMS (Sequence Tagged Microsatellite Site) molecular markers to test the hybrid nature of the F1 obtained in crossing programs. These markers have been proved to be a valuable tool to detect hybrids, being simple to visualize and having a low cost. Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum (Foc), is the major soil-borne fungus affecting this crop, being race 5 (Foc5) the main problem in the Mediterranean basin. In chapter II it describes how it has been possible to delimit the area related to resistance to Foc5 on chromosome 2 of chickpea at 820 kb. For this purpose, STMS markers, gene-specific markers and SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), located in the region of interest, were analyzed in RILs (Recombinant Inbred Lines) and NILs (Near Isogenic Lines). In this window there are 26 genes, including a protein kinase (LOC101511605) that could be considered a candidate gene for their posible implication in resistance reactions. In the same study a collection of 32 genotypes differing in their reactions to Foc5 were analyzed using SNPs markers. The analysis of these markers with clustering methods showed four main groups, three of them grouped resistant genotypes since the fourth one just included susceptible lines. Six of those SNPs were coincident among resistant lines and different from the susceptible ones so, they would be useful in marker-assisted selection. In continuity with this topic, in chapter III, we carried out expression studies by quantitative real-time PCR to analyze the candidate genes in the target region using a pair of NILs differing in their sensitivity to Foc5. Results showed that a cluster of genes were induced by the resistant NIL at 24 hpi (hours post-inoculation), whereas a second cluster contained genes induced by the susceptible NIL at 48 hpi. In the last chapter (IV) the identification and characterization of the gene implicated in the character simple/double pod has been carried out. Usually, chickpea has one flower per node but mutants with two or more flowers have been reported, an interesting feature from an agronomic point of view. In previous studies the double pod mutation in the genotype JG62 was located on chromosome 6 in a 92,6 kb region with 7 genes, pointing CaRAX2-like as the mayor candidate controlling this character. In this study we have identify a deletion around 44 kb in JG62 that includes, among others, CaRAX2-like, this allele has been named sfl-d1. On the other hand, using double pod lines from USDA germoplasm collection, a new double pod allele has been found in the same locus with a point mutation in CaRAX2-like, named sfl-d2. A functional characterization by SEM microscopy and in situ hybridization has been carried out and different plant material has been used to perform controlled crossings. All those analyses allowed us to confirm CaRAX2 as the gene that controls the single/double pod character in chickpea.