Biological control of Verticillium wilt of olive with the nonpathogenic strain of Fusarium oxysporum FO12 and the grape marc compost CGR03

Abstract

Verticillium wilt of olive (VWO) caused by the soil-borne plant pathogen Verticillium dahliae Kleb. is currently considered the most important disease infecting olive groves in most producing countries. To date, there is no truly effective individual method of control, so following an integrated control strategy is the most advisable approach to reduce both its incidence and dispersal. In this context, biological control emerges as one of the most potentially effective measures to implement within this integrated control strategy. Given the scarce of effective biological treatments, the Agroforestry Pathology Group of the University of Córdoba has recently carried out a massive screening of more than 220 natural products against V. dahliae. From that screening, several promising biological treatments were selected given their effectiveness in controlling VWO under controlled conditions. Therefore, the first objective of this PhD thesis was to evaluate the effectiveness of 16 biological treatments, selected in the previous screening, against VWO under field conditions. For that purpose, three experiments were conducted in infested fields with different inoculum densities of V. dahliae and under three different scenarios for the natural infection of the pathogen in the Andalusian Region. Results from those experiments showed that a commercial essential oil from Thymus sp., the non-pathogenic strain of Fusarium oxysporum FO12 and the grape marc compost CGR03 were the most effective treatments in reducing the inoculum density of the pathogen in soil up to 100%. Additionally, FO12 and CGR03 treatments significantly reduced the disease incidence in young and old olive plants in an experiment conducted in a commercial olive orchard. Thus, the non-pathogenic strain of F. oxysporum and the grape marc compost CGR03 were selected as two of the most promising biocontrol treatments against VWO. A second step was evaluating the complete potential of biocontrol as well as expanding the knowledge about the modes of action of FO12 and CGR03. Several in vitro and in vivo experiments were carried out to evaluate the effect of different culture fractions of FO12 against V. dahliae. Treatments with crude culture broth of FO12 resulted in a total reduction of viable propagules of V. dahliae in naturally infested soils as well as in the progression of VWO under controlled conditions. Moreover, treatments with conidial suspension or chlamydospores were also ffective in reducing the inoculum density in the soil and the disease severity in olive plants, reaching values of 95 and 85% of inoculum reduction, respectively. In complementary in vitro and in vivo experiments, the implications of inhibitory substances and rhizosphere competence in antagonistic effects of FO12 against V. dahliae were studied. Volatile organic compounds and soluble substances produced by FO12 caused significant inhibition of mycelial growth and microsclerotia viability. Microscopic analysis using a generated sGFP-tagged strain of FO12 confirmed the endophytic behavior of FO12 showing that this biocontrol strain is an efficient root colonizer which could compete with V. dahliae in the same ecological niche. In parallel, the effects of different compost teas and extracts obtained from the grape marc compost CGR03 were evaluated by means of in vitro and in vivo experiments to identifying the mechanisms of action involved in their effect against V. dahliae. The results suggested that both biotic and abiotic factors are involved in the suppressive effect of this compost, since the natural extract and two extracts sterilized by autoclaving were the most effective aqueous treatments for reducing the inoculum density of V. dahliae in soil (62.0, 72.1 and 66.6% reductions, respectively). Furthermore, the natural compost tea and the compost tea sterilized by autoclaving achieved significant disease suppression rates of 67.4 and 96.5%, respectively. Finally, a long-term experiment under semi-controlled conditions was carried out to evaluate the effectiveness of the non-pathogenic strain of F. oxysporum FO12 and the grape marc compost CGR03 in reducing both the inoculum density of V. dahliae in naturally infested soil and the disease progress in two olive cultivars with different resistance levels (Picual and Arbequina). Both FO12 and CGR03 were highly effective in reducing the inoculum density of the pathogen reaching minimum values of 0.53 and 0.8 propagules g-1, respectively, whereas the minimum value in untreated control was 39.2 propagules g-1. Additionally, CGR03 significantly reduced the progression of the disease whereas FO12 achieved total control of VWO since no plants treated with this strain showed VWO symptoms. The generated knowledge from the studies included in this PhD Thesis, provides useful information about the efficacy of FO12 and CGR03 against VWO and their main modes of action. Furthermore, this work provides new insights of an integrated way to study the complete potential of biocontrol treatments against V. dahliae as an essential part of the development of eco-friendly treatments for controlling VWO. In conclusion, the outcomes obtained in the present study represent an advance in the development of feasible alternatives for the control of this disease under field conditions, where olive farmers are in urgent need of attainable and effective measures to controlling this important disease.

La Verticilosis del olivo (VO) causada por el hongo de suelo Verticillium dahliae Kleb. es considerada la enfermedad más importante que afecta a los olivares en la mayoría de los países productores. Hasta la fecha, no existe un método de control que, aplicado de forma individual, sea realmente efectivo. Por ello, el manejo de la enfermedad mediante una estrategia de control integrado es el enfoque más aconsejable para reducir tanto su incidencia como su dispersión. En este contexto, el control biológico surge como una de las medidas más prometedoras para implementar dentro de esta estrategia de control integrado. Debido a la escasez de tratamientos biológicos efectivos contra la VO, el Grupo de Patología Agroforestal de la Universidad de Córdoba ha llevado a cabo recientemente una evaluación masiva de más de 220 productos naturales contra V. dahliae. Como resultado de esta evaluación, se seleccionaron varios tratamientos biológicos potenciales por su efectividad demostrada frente a la VO en condiciones controladas. Por ello, el primer objetivo de esta Tesis fue evaluar la efectividad de 16 tratamientos biológicos, seleccionados en la anterior evaluación, contra la VO en condiciones de campo. Para ello, se realizaron tres experimentos en campos infestados con diferentes densidades de inóculo de V. dahliae y en tres escenarios diferentes para la infección natural del patógeno situados en diferentes zonas de Andalucía. Los resultados de esos experimentos mostraron que un aceite esencial comercial de Thymus sp., la cepa no patógena de Fusarium oxysporum FO12 y el compost de orujo de vid CGR03 fueron los tratamientos más efectivos para reducir la densidad del inóculo del patógeno en el suelo, consiguiendo hasta un 100% de reducción. Además, los tratamientos con FO12 y CGR03 redujeron significativamente la incidencia de la enfermedad tanto en plantas de olivo jóvenes como en olivos adultos en un experimento realizado en condiciones de un olivar comercial. Por lo tanto, la cepa no patógena de F. oxysporum y el compost de orujo CGR03 se seleccionaron como dos de los tratamientos de biocontrol más prometedores contra la VO. Un segundo paso fue evaluar el potencial completo de biocontrol así como dilucidar los modos de acción tanto de FO12 como de CGR03. Para ello, se realizaron varios experimentos in vitro e in vivo para evaluar el efecto de diferentes formulados a base de FO12 contra V. dahliae. El tratamiento con extracto crudo de FO12 resultó en una reducción total tanto de la densidad de inóculo del patógeno en suelo, como en el progreso de la enfermedad en condiciones controladas. Además, los tratamientos con la suspensión tanto conidial como de clamidosporas también fueron efectivos para reducir tanto la densidad del inóculo (95 y 85 %, respectivamente), como el progreso de la enfermedad en plantones de olivo. En experimentos in vitro e in vivo complementarios, se estudió el papel que desempeñan las sustancias inhibidoras y la competencia en la rizosfera en el efecto antagonista de FO12 contra V. dahliae. Los compuestos orgánicos volátiles y las sustancias solubles producidas por FO12 causaron una inhibición significativa en el crecimiento micelial y en la viabilidad de los microesclerocios. Tras el estudio de microscopía utilizando una cepa de FO12 marcada con sGFP se confirmó el comportamiento endofítico de esta cepa, demostrando que FO12 es un colonizador eficaz de la rizosfera, pudiendo competir por los sitios de infección con V. dahliae. Paralelamente, se evaluó el efecto de diferentes tés y extractos de compost obtenidos a partir de CGR03 para identificar los mecanismos de acción involucrados en su efecto contra V. dahliae. Los resultados obtenidos sugirieron que tanto factores bióticos como abióticos están involucrados en el efecto supresivo de este compost. Así, el extracto natural y dos extractos esterilizados en autoclave fueron los tratamientos más efectivos para reducir la densidad del inóculo de V. dahliae en el suelo (62.0, 72.1 y 66.6% de reducción, respectivamente). Además, el té de compost natural y el té de compost esterilizado en autoclave lograron reducir la enfermedad en un 67.4 y 96.5%, respectivamente. Finalmente, se realizó un experimento en condiciones semi-controladas para evaluar la efectividad de la cepa no patógena de F. oxysporum FO12 y el compost de orujo de vid CGR03 en la reducción tanto de la densidad de inóculo de V. dahliae en un suelo naturalmente infestado como del progreso de la enfermedad y su interacción con dos cultivares de olivo con diferentes niveles de resistencia (Picual y Arbequina). Tanto FO12 como CGR03 fueron altamente efectivos en la reducción de la densidad del inóculo alcanzando valores mínimos de 0.53 y 0.8 propágulos g-1, respectivamente, mientras que en el testigo tuvo un valor mínimo de 39.2 propágulos g-1. Además, CGR03 redujo significativamente el progreso de la enfermedad, mientras que FO12 logró un control total de la VO ya que ninguna planta tratada con esta cepa mostró síntomas de la enfermedad. El conocimiento generado de los estudios incluidos en esta Tesis, proporciona una información útil sobre el efecto de FO12 y CGR03 contra la VO, así como sus principales modos de acción. Además, este trabajo proporciona un nuevo enfoque integrado para estudiar el potencial completo de tratamientos de control biológico contra V. dahliae como parte esencial del desarrollo de futuros tratamientos para controlar la VO. En conclusión, los resultados obtenidos en la presente Tesis representan un avance en el desarrollo de alternativas prometedoras para el control de esta enfermedad en condiciones de campo, donde los olivareros necesitan urgentemente medidas que sean viables, efectivas y respetuosas con el medio ambiente para controlar esta importante enfermedad.