Papel de los microARNs y la inflamación en la patogénesis de enfermedades autoinmunes

Abstract

Las enfermedades autoinmunes sistémicas se desarrollan como consecuencia de un conjunto de interacciones entre factores genéticos predisponentes, la perturbación del sistema inmune y diversos factores ambientales. El Síndrome Antifosfolípido (SAF) se caracteriza por la presencia de trombosis y complicaciones obstétricas, con especial implicación del sistema hemostático y mecanismos inflamatorios asociados. Por otro lado, la Artritis Reumatoide (AR), también asociada a un proceso inflamatorio crónico, se caracteriza por el deterioro progresivo de las articulaciones periféricas. Además, aunque el daño principal de la AR es la sinovitis articular, presenta también alteraciones metabólicas a nivel sistémico, tales como la resistencia a la insulina. De hecho, la enfermedad cardiovascular (ECV) es la principal causa de mortalidad en pacientes SAF y AR. La inflamación y los elementos autoinmunes presentes en estas patologías parecen ser los principales factores desencadenantes de la ECV. Estudios recientes muestran que los microARNs (miRNAs) juegan un papel relevante y novedoso en la regulación epigenética de la expresión de genes y proteínas claves en la patogénesis de estas enfermedades. Por ello, la identificación y caracterización de los miRNAs asociados a estos desordenes autoinmunes podría favorecer la identificación de nuevos biomarcadores que permitan la tipificación clínica de la enfermedad y faciliten su manejo terapéutico. El objetivo principal de esta tesis es investigar el papel de la inflamación y los miRNAs en la patogénesis del SAF y la AR, mediante la integración de aproximaciones inmunológicas, celulares, moleculares y epigenéticas. Principales resultados obtenidos: 1. Hemos identificado una firma molecular de miRNAs circulantes como potenciales biomarcadores de enfermedad en el SAF. Esta firma se asoció a la ocurrencia de perdidas fetales, aterosclerosis y trombosis y correlaciono con parámetros de inflamación, trombosis y autoinmunidad. Además, dicha firma permaneció estable en el tiempo, hecho demostrado por análisis realizados en un intervalo de tiempo de 3 meses. Asimismo, se demostró la especificidad de la firma de miRNAs en pacientes SAF, mediante el análisis paralelo de dos cohortes de pacientes con trombosis pero sin enfermedad autoinmune y pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico sin anticuerpos antifosfolípido, los cuales presentaban perfiles diferenciales. De modo complementario, el análisis mediante clústeres permitió establecer grupos de pacientes con diferente riesgo trombótico y expresión de miRNAs. Estudios mecanísticos in vitro revelaron que los anticuerpos antifosfolípidos promovían la desregulación del perfil de miRNAs analizado y sus potenciales proteínas diana en monocitos y células endoteliales. En suma, se ha identificado una firma de miRNAs diferencialmente expresados en pacientes con SAF como potenciales biomarcadores de la enfermedad que permiten tipificar el estado aterotrombótico de estos pacientes, constituyendo una posible herramienta en la práctica clínica habitual. 2. El estudio del perfil de expresión de miRNAs en neutrófilos de pacientes con AR demostró una reducción global de su expresión, asociado al descenso de genes involucrados en su biogénesis (DICER), así como una sobre-expresión de sus potenciales genes diana involucrados en inflamación y migración celular. Además, dichos niveles reducidos de miRNAs y DICER correlacionaron con mediadores de autoinmunidad, inflamación y el índice de actividad de la enfermedad. Los estudios in vitro revelaron que los anticuerpos antipéptidos cíclico citrulinados (ACPAs) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) promovían una reducción tanto de la expresión de estos miRNAs como de los genes involucrados en su biogénesis, en paralelo al incremento de sus potenciales genes diana. El tratamiento concomitante con fármacos inhibidores de TNF-a revirtió dichos efectos. Transfecciones con agonistas de varios de estos miRNAs mostraron también la especificidad de regulación de sus genes diana asociados con inflamación, supervivencia y migración celular. Adicionalmente, el silenciamiento del gen clave en el proceso de biogénesis de miRNAs, DICER, influencio de manera significativa el perfil inflamatorio de los neutrófilos. En suma, los neutrófilos en el contexto de AR exhiben una reducida expresión de miRNAs, promovida por los principales inductores de la activación patogénica de este tipo celular: autoanticuerpos y mediadores inflamatorios. Asimismo, la maquinaria de biogénesis de miRNAs se encuentra significativamente alterada en los neutrófilos de estos pacientes y fuertemente asociada con una desregulación de los miRNAs relacionados con la migración e inflamación en neutrófilos sinoviales. Finalmente, terapias dirigidas contra TNF-a podrían modular estos niveles de expresión de miRNAs, minimizando de este modo el perfil inflamatorio. 3. El estudio de la actividad inflamatoria en pacientes con AR y su implicación en la alteración del metabolismo glucídico y lipídico demostró, en primer lugar, que los pacientes con AR mostraron una fuerte asociación entre el grado de inflamación sistémica y el desarrollo de resistencia a insulina. Estos resultados fueron corroborados mediante el desarrollo de un modelo murino de artritis inducida por colágeno que resulto en un estado de inflamación global caracterizado por un metabolismo defectuoso de la glucosa y de los lípidos en diferentes tejidos, siendo el tejido adiposo el principal tejido afectado y el más susceptible a las alteraciones inducidas por la AR. Estos resultados fueron confirmados asimismo mediante estudios in vitro, tras tratamiento de adipocitos con el suero de pacientes con AR. En su conjunto, los datos obtenidos en este estudio han mostrado como las alteraciones metabólicas observadas en pacientes AR dependen del grado de inflamación e identifica al tejido adiposo como el principal tejido diana para el desarrollo de resistencia a insulina. Por tanto, estrategias terapéuticas dirigidas a controlar el estatus inflamatorio podrían permitir normalizar o prevenir las alteraciones metabólicas asociadas con la AR. En suma, los resultados globales obtenidos en esta tesis doctoral han permitido identificar potenciales biomarcadores del estatus de la enfermedad y sus comorbilidades asociadas en pacientes con Síndrome Antifosfolípido y Artritis Reumatoide, así como diversos mecanismos moleculares asociados a procesos patológicos clave en estas enfermedades, tales como la ECV. Dichos resultados podrían sentar las bases para la realización de estudios futuros, cuyo fin sea desarrollar una medicina personalizada dirigida a optimizar el cuidado de los pacientes con enfermedades autoinmunes sistémicas.

Systemic autoimmune diseases (including antiphospholipid syndrome and rheumatoid arthritis) are the result of a complex interaction between predisposing genetic factors, disturbance of the immune system, and several environmental factors. Antiphospholipid Syndrome (APS) is characterized by the presence of thrombosis and obstetric complications, with special involvement of the hemostatic system and associated inflammatory mechanisms. On the other hand, Rheumatoid Arthritis (RA), also associated with a chronic inflammatory process, is characterized by the progressive deterioration of the peripheral joints. Furthermore, although the main focus of RA is joint synovitis, it also presents extra-articular manifestations such as metabolic disorders and cardiovascular disease. In fact, cardiovascular disease (CVD) is the main cause of mortality in both, APS and RA patients. Inflammation and the autoimmune elements seem to be the main triggers for CVD in these pathologies. Recent studies showed that microRNAs (miRNAs) are involved in crucial cellular processes and their dysregulation has been described in many cell types and fluids in a broad range of diseases. Therefore, the characterization of the miRNAs associated with the pathogenesis of systemic autoimmune disorders, such as APS and RA, could identify new biomarkers that might facilitate its diagnosis, outcome and therapeutic management. The main objective of this thesis is to investigate the role of inflammation and miRNAs in the pathogenesis of APS and RA, through the integration of immunological, cellular, molecular and epigenetic approaches. Main results obtained: 1. We have identified a molecular signature of circulating miRNAs as potential disease biomarkers in APS. This signature was associated with the occurrence of fetal loss, atherosclerosis, and thrombosis and correlated with parameters of inflammation, thrombosis, and autoimmunity. Furthermore, this signature remained stable over time, a fact demonstrated by analysis carried out in a time interval of 3 months. Likewise, the specificity of the signature of miRNAs in APS patients was demonstrated, through the parallel analysis of two cohorts of patients with thrombosis but without autoimmune disease and patients with Systemic Lupus Erythematosus without antiphospholipid antibodies, which displayed differential profiles. In addition, hard clustering analysis established groups of patients with different thrombotic risk and expression of miRNAs. In vitro mechanistic studies revealed that antiphospholipid antibodies promoted the dysregulation of the analyzed miRNA profile and its potential target proteins in monocytes and endotelial cells. In sum, differentially expressed circulating miRNAs in APS patients, modulated at least partially by antiphospholipid antibodies of IgG isotype, might have the potential to serve as novel biomarkers of disease features and to typify patients’ atherothrombotic status, thus constituting a useful tool in the management of the disease. 2. The study of the expression profile of miRNAs in neutrophils of RA patients showed an overall reduction in their expression, associated with the decrease in genes involved in their biogenesis (DICER), as well as an over-expression of their potential target genes involved in inflammation and cell migration. Furthermore, these reduced levels of miRNAs and DICER correlated with mediators of autoimmunity, inflammation and disease activity. In vitro studies revealed that anti-citrullinated protein antibodies (ACPAs) and tumor necrosis factor alpha (TNF-a) promoted a reduction in both the expression of these miRNAs and the genes involved in their biogenesis, in parallel with the increase in their potential target genes. Concomitant treatment with TNFinhibitors could reverse these effects. Transfections with agonists of several of these miRNAs also showed the regulatory specificity of their target genes associated with inflammation, survival, and cell migration. Additionally, the silencing of the key gene in the miRNA biogenesis process, DICER, significantly influenced the inflammatory profile of neutrophils. In sum, neutrophils in the context of RA exhibit reduced expression of miRNAs, promoted by the main inducers of pathogenic activation of this cell type: autoantibodies and inflammatory mediators. Likewise, the biogenesis machinery of miRNAs is significantly altered in the neutrophils of these patients and strongly associated with a dysregulation of miRNAs related to migration and inflammation in synovial neutrophils. Finally, therapies directed against TNF-a could modulate these expression levels of miRNAs, thus minimizing the inflammatory profile. 3. The study of the inflammatory activity in patients with RA and its implication in the alteration of the glucose and lipid metabolism showed, first of all, that there was a strong association between the degree of systemic inflammation and the development of insulin resistance. These results were corroborated through the development of a murine model of collagen-induced arthritis that resulted in a state of global inflammation characterized by a defective metabolism of glucose and lipids in different tissues, being adipose tissue the main affected tissue and the more susceptible to the alterations induced by RA. These results were also confirmed by in vitro studies, after treatment of adipocytes with the serum of RA patients. Taken together, the data obtained in this study indicates how the metabolic alterations observed in RA patients depend on the degree of inflammation and identify adipose tissue as the main target tissue for the development of insulin resistance. Therefore, therapeutic strategies focused on tightly controlling the inflammatory status could reduce or prevent the metabolic disorders associated with RA. In sum, the global results obtained in this doctoral thesis allowed the identification of potential biomarkers of the status of the disease and its associated comorbidities in patients with Antiphospholipid Syndrome and Rheumatoid Arthritis, as well as various molecular mechanisms related to key pathological processes in these diseases, such as CVD. These results could pave the way for future studies, based on the development of personalized medicine aimed at optimizing the care of patients with systemic autoimmune diseases.