Mediators of the cellular response to the development of obesity and metabolic disease

Abstract

Obesity is the pandemic of the 21st century. Overall, about 15% of the world’s adult population is obese, and if the rising trend continues, it is estimated that global prevalence reaches 20% by 2025. Obesity poses a major public health issue due to its elevated risks for adverse health consequences, including several serious chronic diseases, such as insulin resistance (IR), type 2 diabetes (T2D), non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), cardiovascular disease, dyslipidemia, hypertension, stroke, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, arthritis, asthma, neurodegenerative diseases, and even certain forms of cancer. Many factors and mechanisms have been implicated in obesity pathogenesis, but their trigger is uncertain, and the causal relationship between them and the complications of obesity remains in question. However, there is little doubt that obesity is closely associated with adipose tissue dysfunction, and that this condition leads to the development of metabolic diseases. Adipose tissue is a complex organ with primary roles in energy homeostasis control. Thus, adipose tissue not only acts as a reservoir for energy storage and utilization, but also it senses energy demands and secretes signalling factors to regulate other metabolic tissues. However, in obesity, adipose tissue may become severely dysfunctional and not expand properly to store the energy excess. This induces ectopic fat deposition in other tissues involved in the maintenance of glucose homeostasis, an event commonly defined as “lipotoxicity”. It has been extensively demonstrated that excessive lipid accumulation in ectopic tissues leads to local inflammation and IR. Numerous pathogenic processes have been associated with the unhealthy expansion of the adipose tissue, including inflammation, fibrosis, hypoxia, altered adipokines secretion, mitochondrial dysfunction, hyperinsulinemia, endoplasmic reticulum (ER), and oxidative stress. Dietary and lifestyle, as well as therapeutic interventions, can be adequate to treat obesity and prevent metabolic alterations. Nevertheless, the exact molecular and cellular mechanisms underlying adipose tissue dysfunction and its implications in the development of metabolic disturbances are broadly unknown. Improving our understanding in this field might lead to the development of new approaches and the identification of therapeutic targets for treating obesity. In this Doctoral Thesis, we aimed at identifying potential factors and pathway markers relevant to the loss of adipose tissue function in obesity and their relationship to obesityrelated IR/T2D. To this end, we analysed human adipose tissue samples in combination with both human and murine cell lines, using state-of-the-art methodologies to investigate adipose tissue functionality in obesity and in response to weight loss upon bariatric surgery (BS), and their corresponding mechanisms associated with metabolic alterations or recovery, respectively. Specifically, to reach this general goal, we have carried out two separate studies, which are depicted in detail below. 1. Study 1: Identification of pathogenic markers of metabolic disease in preadipocytes of obese individuals Adipose precursor cells, the preadipocytes, are essential for the maintenance of adipose tissue homeostasis, regeneration, and expansion. Preadipocytes differentiation into adipocytes (i.e., adipogenesis) enables adipocyte turnover and adipose tissue growth, and ensures adipose tissue plasticity to accommodate surplus energy. It has been proposed that the inability for recruiting new adipose cells, together with the functional impairment of hypertrophied adipocytes that occur in obesity, contributes to lipid spillover from the adipose tissue. Thus, increasing adipogenesis appears as a valuable strategy to facilitate healthy adipose tissue expansion and ensure metabolic health. Adipocyte differentiation relies on major changes in gene expression programs regulating mRNA and protein production. An increasing body of evidence shows that mRNA processing and, in particular, alternative splicing, is crucial for genome reprogramming during cell differentiation. However, the splicing components relevant to adipogenesis and the cellular events regulated by alternative splicing during adipocyte differentiation have been scarcely explored, and it is yet to be established whether alternative splicing is modified in human obesity. Another crucial mechanism preserving precursor cell function relates to protein homeostasis (i.e., proteostasis), which maintains the capacity of cells to expand in order to sustain tissue growth and regeneration. Several lines of evidence support an important role for the endoplasmic reticulum (ER) protein quality control system in the regulation of adipogenesis. In fact, the unfolded protein response (UPR) is perturbed in the obese adipose tissue, and it has been proposed to contribute to the pathology of obesity. By contrast, it is still unknown whether the other component of the protein control system, the ER-associated protein degradation (ERAD), which is crucial for protecting cells against the accumulation of misfolded/unfolded proteins and proteotoxicity, is altered in the obese adipose tissue. Here, in order to identify altered molecular pathways that may contribute to metabolic disease in obesity, we set out an iTRAQ-LC-MS/MS proteomic approach for the analysis of subcutaneous (SC) and omental (OM) preadipocytes from obese individuals with normoglycaemia (NG) and T2D. Down-regulation of multiple components of the splicing machinery was observed in SC preadipocytes from obese individuals with insulin resistance (IR) or T2D, as compared to NG obesity. This, together with the observation that adipogenesis can be modulated by regulating the expression levels of a key spliceosome component, PRFP8/PRP8, supports a role for alternative splicing in the development of obesity-associated metabolic complications. In addition, our studies show that not only the UPR is altered in human SC and OM preadipocytes from IR/T2D obese subjects, but also that the ERAD system is hyperactivated. This condition, when mimicked in vitro, prevented adipogenesis. Our results provide novel mechanistic explanations for the impaired adipogenic capacity observed in IR/T2D obesity that relates to both mRNA and ER-proteostasis disturbances. 2. Study 2: Characterization of miRNAs as markers of dysfunctional adipose tissue in type 2 diabetes (T2D) It is increasingly accepted that, besides adipokines, the adipose tissue is a major physiological source of circulating microRNAs (miRNAs). miRNAs, a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate gene expression, have emerged as key molecules for cell function. Anomalous miRNA levels and alterations in their biogénesis machinery have been related to several metabolic diseases, including obesity as well as T2D, and dyslipidemia. miRNAs are also actively secreted into the circulation and have been proposed to act as messengers for intercellular communication. This characteristic has pointed out circulating miRNAs as potential biomarkers for disease and altered circulating levels of numerous miRNAs have been associated with metabolic disorders. In this scenario, in order to design targeted preventive therapeutic strategies, it is critical to identify the early mechanisms that precede disease onset. Recently, the predictive value of a number of miRNAs for the diagnosis of T2D incidence was assessed in the CORonary Diet Intervention with Olive oil and cardiovascular PREVention (CORDIOPREV) study (ClinicalTrial.gov ID: NTC00924937), a prospective study carried out in 1,002 patients with coronary heart disease and high cardiovascular risk. These studies demonstrated that, when combined with HbA1c, a group of nine miRNAs (miR-9, miR-28-3p, miR-29a, miR-30a-5p, miR- 103, miR-126, miR-150, miR-223-3p, and miR-375), provided a higher predictive value in T2D diagnosis than clinical parameters. The relationship between baseline levels of these miRNAs with markers of beta-cell function and systemic and peripheral IR was also investigated. However, their potential association with adipose tissue deregulation was not analyzed. This is of interest as adipose tissue dysfunction has been proposed as a major contributing factor for the development of T2D, and adipose tissue miRNA expression profile is altered in obesity and T2D. In this line, several cross-sectional human studies have shown that the obesity-related expression pattern of specific circulating miRNAs reflects their miRNA adipose tissue expression profiles, supporting a role for circulating miRNAs as adipose tissue biomarkers. However, the relationship between circulating miRNAs and adipose tissue functional state is not fully understood, yet it might be useful to identify adipose tissue-related metabolic complications. In this scenario, we aimed at analyzing the relationship between previously established predictive miRNAs for T2D onset in the CORDIOPREV cohort (Jiménez- Lucena et al., 2018) and the loss of adipose tissue insulin sensitivity. Once established that circulating miR-223-3p was dysregulated in relation to adipose tissue function, we performed functional analysis to elucidate both the potential of preadipocytes and adipocytes as miR-223-3p secreting cells, and the consequences of miR-223-3p dysregulation on adipocyte biology. Our results indicate that miR-223-3p secretion by preadipocytes and adipocytes is prevented under inflammatory conditions, and that its pathogenic accumulation leads to alterations in both glucose and lipid metabolism in these cells. These observations could answer to the lower circulating levels on this miRNA found in those patients who are going to develop T2D, as well as explain its underlying role as a potential predictor of adipose dysfunction related to T2D development. We have also demonstrated that the changes that occur in the circulating milieu after BS-induced weight-loss modulate miR-223-3p expression by adipocytes. The relevance of these observations was further supported by our functional studies in adipocytes exposed to pre- and post-BS serum, where the post-BS serum improved the insulininduced glucose uptake in adipocytes, in comparison with those cells exposed to pre- BS. These findings further support the notion that inflammatory mediators present in either the serum, or locally in the adipose tissue, may be responsible for the alterations in miR-223-3p regulation. In sum, when viewed together, our studies indicate that impaired splicing and disturbed ER-proteostasis are components of the pathogenic molecular fingerprint of preadipocytes that could be targeted to prevent and/or improve adipose tissue dysfunction in obesity and its related metabolic disorders. Likewise, our data support the notion that miR-223-3p may have a role as a potential predictor of adipose dysfunction related to T2D development, thus unveiling a novel molecular target that may be helpful to design novel therapeutic strategies to prevent T2D.

La obesidad es la pandemia del siglo XXI. En conjunto, alrededor del 15% de la población adulta mundial es obesa. Si la tendencia al alza continúa, se estima que la prevalencia mundial alcanzará el 20% para el 2025. Así, la obesidad plantea un problema importante de salud pública debido a sus elevados riesgos para la salud, entre ellas varias enfermedades crónicas graves, como resistencia a insulina (IR), diabetes tipo 2 (T2D), enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), enfermedad cardiovascular, dislipidemia, hipertensión, accidente cerebrovascular, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, artritis, asma, enfermedades neurodegenerativas e incluso ciertas formas de cáncer. Diversos factores y mecanismos han sido implicados en la patogénesis de la obesidad, pero su desencadenante es incierto. Además, la relación causal entre ellos y las complicaciones de la obesidad permanece sin resolver. Sin embargo, hay pocas dudas de que la obesidad está estrechamente asociada con la disfunción del tejido adiposo, y que esta condición conduce al desarrollo de enfermedades metabólicas. El tejido adiposo es un órgano complejo con funciones principales en el control de la homeostasis energética. Por lo tanto, el tejido adiposo no solo actúa como un depósito para el almacenamiento y la utilización de energía, sino que también detecta las demandas de energía, y secreta factores de señalización para regular otros tejidos metabólicos. Sin embargo, en obesidad, el tejido adiposo puede volverse gravemente disfuncional, y no expandirse adecuadamente para almacenar el exceso de energía. Esto induce el depósito ectópico de grasa en otros tejidos involucrados en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa, un evento comúnmente definido como "lipotoxicidad". Se ha demostrado ampliamente que la acumulación excesiva de lípidos en tejidos ectópicos provoca inflamación local e IR. Numerosos procesos patogénicos se han asociado con la expansión no saludable del tejido adiposo, que incluyen: inflamación, fibrosis, hipoxia, secreción alterada de adipoquinas, disfunción mitocondrial, hiperinsulinemia, y estrés de retículo endoplásmico (ER) y oxidativo. Las intervenciones dietéticas y de estilo de vida, así como las terapéuticas, pueden ser adecuadas para tratar la obesidad y prevenir alteraciones metabólicas. Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares exactos que subyacen a la disfunción del tejido adiposo, y sus implicaciones en el desarrollo de alteraciones metabólicas son ampliamente desconocidos. Mejorar nuestra comprensión en este campo podría conducir al desarrollo de nuevos enfoques y a la identificación de dianas terapéuticas para tratar la obesidad. En esta Tesis Doctoral, nuestro objetivo fue identificar los posibles factores y marcadores de las vías relevantes para la pérdida de la función del tejido adiposo en obesidad, y su relación con IR/T2D asociadas. Para ello, analizamos muestras de tejido adiposo humano en combinación con líneas celulares, tanto humanas como murinas, utilizando metodologías de vanguardia para investigar la funcionalidad del tejido adiposo en obesidad, y su respuesta a la pérdida de peso tras cirugía bariátrica (BS). Así como, sus correspondientes mecanismos asociados con alteraciones metabólicas o de recuperación, respectivamente. Específicamente, para alcanzar este objetivo general, hemos llevado a cabo dos estudios separados, que se describen en detalle a continuación. 1. Estudio 1: Identificación de marcadores patogénicos de enfermedad metabólica en preadipocitos de individuos obesos Las células adiposas precursoras, los preadipocitos, son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis, regeneración y expansión del tejido adiposo. La diferenciación de los preadipocitos en adipocitos (adipogénesis) permite el recambio de adipocitos y el crecimiento del tejido adiposo, y asegura la plasticidad de este tejido para acomodar el exceso de energía. Se ha propuesto que la incapacidad para reclutar nuevas células adiposas, junto con el deterioro funcional de los adipocitos hipertróficos que ocurre en obesidad, contribuye al derrame de lípidos del tejido adiposo. Por lo tanto, el aumento de la adipogénesis aparece como una estrategia valiosa para facilitar la expansión saludable del tejido adiposo y salvaguardar la salud metabólica. La diferenciación de adipocitos se basa en cambios importantes en los programas de expresión génica que regulan la producción de ARNm y proteínas. Un creciente número de evidencias muestra que el procesamiento del ARNm y, en particular, el empalme alternativo, es crucial para la reprogramación del genoma durante la diferenciación celular. Sin embargo, los componentes de empalme relevantes para la adipogénesis y los eventos celulares regulados por este empalme alternativo durante la diferenciación de adipocitos apenas se han explorado. Así mismo, aún no se ha establecido si el empalme alternativo se modifica en la obesidad humana. Otro mecanismo crucial que preserva la función de las células precursoras se relaciona con la homeostasis de las proteínas (proteostasis), que mantiene la capacidad de las células de expandirse para mantener el crecimiento y la regeneración de los tejidos. Varias líneas de evidencia apoyan un papel importante para el sistema de control de calidad proteico del retículo endoplásmico (ER) en la regulación de la adipogénesis. De hecho, la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) se perturba en el tejido adiposo obeso, y se ha propuesto que contribuye a la patología de la obesidad. Por el contrario, todavía se desconoce si otro componente del sistema de control de proteínas, la degradación de proteínas asociada a ER (ERAD), que es crucial para proteger las células contra la acumulación de proteínas mal plegadas/desplegadas y la proteotoxicidad, está alterado en el tejido adiposo obeso. Aquí, con el fin de identificar vías moleculares alteradas que pueden contribuir a la enfermedad metabólica en obesidad, realizamos un estudio proteómico de iTRAQ-LCMS/ MS para el análisis de preadipocitos subcutáneos (SC) y omentales (OM) de individuos obesos con normoglucemia (NG) y T2D. Se observó una disminución de múltiples componentes de la maquinaria de empalme en preadipocitos SC de individuos obesos con IR o T2D, en comparación con los obesos NG. Esto, junto con la observación de que la adipogénesis puede modularse regulando los niveles de expresión de un componente clave del espliceosoma, PRPF8/PRP8, respalda el papel de este proceso en el desarrollo de complicaciones metabólicas asociadas a la obesidad. Además, nuestros estudios muestran que no solo el sistema UPR está alterado en preadipocitos humanos SC y OM de sujetos obesos con IR/T2D, sino que también existe una hiperactivación del sistema ERAD. Esta condición, cuando se imita in vitro, previene la adipogénesis. Nuestros resultados proporcionan novedosas explicaciones mecanicistas para la capacidad adipogénica deteriorada observada en los obesos IR/T2D que se relaciona tanto con la alteración del procesamiento de ARNm como con la de la proteostasis del ER. 2. Estudio 2: Caracterización de miRNAs como marcadores de tejido adiposo disfuncional en la diabetes tipo 2 (T2D) Cada vez se acepta más que, además de las adipoquinas, el tejido adiposo es una importante fuente fisiológica de microRNAs (miRNAs) circulantes. Los miRNAs, una clase de pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica posttranscripcionalmente, han surgido como moléculas clave para la función celular. Los niveles de miRNAs anómalos y las alteraciones en su maquinaria de biogénesis se han relacionado con varias enfermedades metabólicas, incluida la obesidad, así como la T2D y la dislipidemia. Los miRNAs también se secretan activamente a la circulación y se ha propuesto que actúen como mensajeros de la comunicación intercelular. Esta característica ha señalado a los miRNAs circulantes como posibles biomarcadores de enfermedades, y los niveles circulantes alterados de numerosos miRNAs se han asociado con trastornos metabólicos. En este escenario, para diseñar estrategias terapéuticas preventivas específicas, es fundamental identificar los mecanismos tempranos que preceden al inicio de la enfermedad. Recientemente, en el estudio CORonary Diet Intervention with Olive oil and cardiovascular PREVention (CORDIOPREV, ClinicalTrial.gov ID: NTC00924937), se evaluó el valor predictivo de varios miRNAs para el diagnóstico de incidencia de T2D, un estudio prospectivo realizado en 1,002 pacientes con enfermedad coronaria y alto riesgo cardiovascular. Estos estudios demostraron que, cuando se combina con HbA1c, un grupo de nueve miRNAs (miR-9, miR-28-3p, miR-29a, miR-30a-5p, miR-103, miR- 126, miR-150, miR-223-3p, y miR-375), proporcionaron un valor predictivo más alto en el diagnóstico de T2D que los parámetros clínicos. También se investigó la relación entre los niveles basales de estos miRNAs con marcadores de la función de las células beta y la IR sistémica y periférica. Sin embargo, su posible asociación con la desregulación del tejido adiposo no se analizó. Esto es de interés ya que se ha propuesto que la disfunción del tejido adiposo es un factor importante que contribuye al desarrollo de T2D, y el perfil de expresión de miRNAs del tejido adiposo está alterado en obesidad y T2D. En esta línea, varios estudios transversales en humanos han demostrado que el patrón de expresión de específicos miRNAs circulantes, relacionados con obesidad, refleja los perfiles de expresión de estos miRNAs en el tejido adiposo, lo que respalda el papel de los miRNAs circulantes como biomarcadores del tejido adiposo. Sin embargo, la relación entre los miRNAs circulantes y el estado funcional del tejido adiposo no se comprende completamente, lo cual podría ser útil para identificar las complicaciones metabólicas relacionadas con el tejido adiposo. En este escenario, nuestro objetivo fue analizar la relación entre los miRNAs predictivos para el inicio de T2D, previamente establecidos en la cohorte CORDIOPREV (Jiménez-Lucena et al., 2018), y la pérdida de sensibilidad a insulina del tejido adiposo. Una vez establecido que el miR-223-3p circulante estaba desregulado con relación a la función del tejido adiposo, realizamos un análisis funcional para dilucidar tanto el potencial de los preadipocitos y los adipocitos como células secretoras de miR-223-3p, como las consecuencias de la desregulación de este miRNA sobre la biología de los adipocitos. Así, nuestros resultados indican que la secreción de miR-223-3p por preadipocitos y adipocitos es inhibida en condiciones inflamatorias, y que su acumulación patológica provoca alteraciones tanto en el metabolismo glucídico como lipídico de estas células. Estas observaciones podrían dar respuesta a los bajos niveles de este miRNA encontrados en aquellos pacientes que van a desarrollar T2D, así como explicar su potencial predictor de la disfunción adiposa relacionada con el desarrollo de esta enfermedad. También hemos demostrado que los cambios que ocurren en el medio circulante después de la pérdida de peso inducida por BS modulan la expresión de miR-223-3p en adipocitos. La relevancia de estas observaciones fue apoyada además por nuestros estudios funcionales en adipocitos expuestos a suero pre- y post-BS, donde el suero post-BS mejoró la captación de glucosa estimulada por insulina en adipocitos, en comparación con aquellos expuestos a sueros pre-BS. Estos hallazgos refuerzan aún más la idea de que los mediadores inflamatorios presentes en el suero, o localmente en el tejido adiposo, pueden ser responsables de las alteraciones en la regulación de miR- 223-3p. En resumen, cuando se ven en conjunto, nuestros estudios indican que el empalme deficiente y la alteración de la proteostasis del ER son componentes de la huella molecular patogénica de los preadipocitos que podrían ayudar a prevenir y/o mejorar la disfunción del tejido adiposo en obesidad y sus trastornos metabólicos relacionados. Del mismo modo, nuestros datos respaldan la noción de que miR-223-3p puede tener un papel como potencial predictor de la disfunción adiposa relacionada con el desarrollo de T2D, revelando así una nueva diana molecular que puede ser útil para diseñar nuevas estrategias terapéuticas para prevenir la T2D.