Caracterización funcional de mecanismos reguladores del proceso de la maduración del fruto de fresa

Abstract

Durante el desarrollo de esta tesis doctoral, se han estudiado algunos procesos que regulan el proceso de maduración del fruto de fresa (Fragaria × ananassa). Análisis transcriptómicos masivos realizados previamente en nuestro grupo de investigación permitieron la identificación de varios factores de transcripción (FTs) y proteínas reguladoras inducidas durante la maduración del fruto de fresa. Se comprobó que la expresión de estos genes estaba regulada por hormonas, sugiriendo así, que pueden controlar diferentes procesos fisiológicos responsables de las características organolépticas del fruto maduro. Dentro de esos genes, se seleccionó a FaPRE1 que codifica una proteína HLH atípica con alta homología de secuencia con genes de tipo PACLOBUTRAZOL RESISTANCE (PRE). Los FTs de tipo bHLH contienen dos dominios claramente diferenciados, uno básico localizado en el extremo amino de la proteína, que contiene entre 13 a 17 aminoácidos básicos, y una región HLH, localizada en el extremo carboxilo que contiene dos regiones α-hélice anfipáticas ricas en aminoácidos hidrofóbicos. Las proteínas de tipo HLH carecen de las secuencias necesarias para la unión al ADN y, en consecuencia, no presentan esta habilidad. Así, los genes de tipo PRE codifican proteínas de la familia bHLH caracterizadas por la ausencia del dominio de unión al ADN y que, por lo tanto, necesitan de otras proteínas para modular la expresión de otros genes. En este trabajo, se identificaron tres genes de tipo PRE en el genoma de fresa con más de un 90% de homología entre sus secuencias aminoacídicas. Sus perfiles transcriptómicos indicaron que, mientras FaPRE2 y 3, se expresaban exclusivamente en tejidos vegetativos, FaPRE1 se inducía a lo largo de la maduración del fruto presentando una expresión muy baja en el resto de los tejidos analizados. Además, su expresión fue inducida por ABA, reprimida por auxinas (ambas hormonas relacionadas con el control de la maduración del fruto), y no se afectó por giberelinas. Este hecho se puede explicar debido a la presencia de secuencias cis de respuesta a ABA y la ausencia de éstas para giberelinas en el promotor de FaPRE1. Cuando la expresión de FaPRE1 fue transitoriamente silenciada mediante la infiltración de Agrobacterium portando la construcción ARNi de este gen, no se observaron cambios fenotípicos que afectaran al proceso de maduración del fruto. No obstante, el estudio transcriptómico comparativo de frutos control y frutos transgénicos FaPRE1-ARNi reveló que 227 y 276 genes fueron silenciados y sobreexpresados respectivamente en estas condiciones experimentales. Del conjunto de genes silenciados, el 70% presentó un perfil de expresión relacionado con el proceso de maduración mientras que el 76% de los sobreexpresados mostraron un incremento de expresión en el estadio verde frente al rojo. Estos resultados indican que FaPRE1 regula antagónicamente la expresión de genes relacionados con el desarrollo o la maduración del fruto rojo. Es decir, en el receptáculo maduro, FaPRE1 reprime la expresión de genes relacionados con el desarrollo mientras que activa la expresión de otros relacionados con la maduración. Los FTs son esenciales para la modulación de la expresión génica por ello, el FT de tipo R2R3 FaMYB123 fue también seleccionado para su estudio en mayor profundidad. Este tipo de FTs se caracterizan por incluir dos repeticiones imperfectas de tipo MYB seguidas de la estructura R2-R3 de las proteínas c-MYB. Para llevar a cabo su función reguladora, interaccionan con otras proteínas formando complejos MBW que regulan múltiples rutas metabólicas y de desarrollo. Además, FaMYB123 se localiza en el núcleo celular. La expresión espacio temporal de FaMYB123 indica que está asociado al proceso de maduración de la fresa y que su expresión es prácticamente específica de fruto, ya que presenta niveles de expresión muy bajos en aquenios y en otros tejidos vegetativos de la planta. Además, su expresión se induce por ABA y se reprime por auxinas, lo que sugiere que FaMYB123 debe regular procesos relacionados con la maduración del fruto. Para comprender el papel regulador de este FT en fresa, se generaron plantas transgénicas estables con la expresión de FaMYB123 silenciada (FaMYB123-ARNi). Aquellas líneas que presentaron los niveles de silenciamiento más altos (≥ 95%) fueron seleccionadas para realizar estudios metabolómicos y de expresión génica. Así, el análisis de expresión comparativo entre las líneas transgénicas FaMYB123-ARNi y las líneas control mostró un claro silenciamiento de genes relacionados con la síntesis de antocianinas y flavonoides. Estos compuestos son sintetizados a lo largo de la maduración del fruto de fresa y son determinantes para la adquisición de las sus propiedades organolépticas características. Los resultados transcriptómicos obtenidos fueron validados posteriormente mediante el análisis metabolómico de las mismas muestras en colaboración con el grupo del Dr. Alisdair Fernie durante dos estancias predoctorales realizadas en el Max Planck Institute For Molecular Plant Physiology (Potsdam, Alemania). En este sentido, los análisis metabolómicos realizados revelaron un desajuste en la concentración entre antocianinas y proantocianidinas. Así, mientras que los receptáculos de frutos transgénicos presentaban menor cantidad de antocianinas del tipo pelargonidina-3-glucósido y su derivado malonilo, sí acumulaban una mayor concentración de proantocianidinas, compuestos presentes predominantemente en frutos verdes de fresa y relacionados con sus etapas de desarrollo. Estudios de interacción de proteínas realizados demostraron que FaMYB123 interaccionaba con FabHLH3, un FT identificado como regulador de la síntesis de proantocianidinas mediante su unión con FaMYB9. Estos datos sugieren la posible regulación de la síntesis de antocianinas y proantocianidinas a través de la formación de un complejo FabHLH3-MYB9/123. Estudios moleculares y fisiológicos posteriores parecen indicar que FaMYB123 controla la expresión de genes relacionados con la síntesis de antocianinas y flavonoles, compuestos que normalmente se acumulan en receptáculos maduros. La metilación del ADN es un mecanismo muy común de regulación de la expresión génica en plantas. Estas marcas epigenéticas han sido relacionadas con el silenciamiento de la expresión de aquellos genes que las poseen. No obstante, se ha descrito recientemente que la metilación también puede inducir la transcripción de ciertos genes y/o puede ser necesaria para el anclaje correcto de ciertos factores de transcripción a los promotores cuya expresión deben activar. Se sabe que el patrón de metilación del ADN puede ser alterado mediante la aplicación de compuestos químicos que hiper- o hipometilan dicha molécula. Entre esos compuestos, uno de los más usados es la 5- azacitidina (AZA) que, al ser un análogo de la citosina, puede incorporarse al ADN para pasar a formar parte de su estructura. Allí, se une covalentemente a las ADN metiltransferasas que son degradadas debido a esta unión. De esta manera, las marcas epigenéticas son eliminadas después de varias replicaciones del ADN. Aunque el control epigenético de la maduración del fruto ha sido mayoritariamente estudiado en tomate, se ha comprobado que la aplicación de AZA a diferentes frutos produjo un adelanto de su maduración en todos los casos. Sin embargo, su aplicación a mitades de frutos blancos de fresa produjo la respuesta contraria y la paralización del proceso de maduración del fruto en dicha zona. El análisis transcriptómico de la zona tratada y la zona control mediante secuenciación del ARN revelaron la ausencia de inducción de FTs relacionados con el control de procesos típicos de la maduración en las zonas tratadas. De igual manera, la transcripción de varios genes asociados a la síntesis de hormonas, aroma, color y textura del fruto estaba reprimida o no se produjo en la zona del fruto tratada con AZA. Los frutos no climatéricos como la fresa no regulan su maduración por etileno. En este caso, es el balance entre auxinas y ABA el que determina esta regulación. Así, después del tratamiento con AZA, los genes relacionados con la biosíntesis de ABA fueron silenciados mientras que los implicados en su degradación aumentaron su expresión. De igual manera, genes implicados en la biosíntesis de auxinas y de giberelinas también fueron sobrexpresados en la zona del fruto tratada con AZA. Además, se comprobó que el perfil metabólico de estos mismos frutos fue más parecido al de frutos en estadio blanco de maduración, con concentraciones de antocianinas prácticamente nulas y niveles hormonales similares a los de estadios del fruto en fase de desarrollo. Así, en la zona del fruto tratada con AZA, se detectó una menor concentración de ABA bioactiva y un incremento de sus productos de degradación. De la misma manera, la concentración de auxinas y giberelinas fue mayor en la zona del fruto tratada con AZA que en la zona control, lo que indica un desajuste del contenido hormonal en este tejido. En consecuencia, el tratamiento con AZA produjo una paralización completa del proceso de maduración del fruto de fresa debido a una alteración en su contenido hormonal que se tradujo en una alteración de la expresión génica y del contenido metabólico del fruto. Este trabajo establece que las marcas epigenéticas son necesarias para el proceso de maduración del fruto de fresa y, por lo tanto, es un punto de partida para el desarrollo de nuevos trabajos que profundicen en esta regulación. Finalmente, el gen FaCXE2, que codifica una enzima de tipo carboxilesterasa (CXE), fue seleccionado para su estudio en mayor profundidad. Las carboxilesterasas son enzimas hidrolíticas que pertenecen a la superfamilia α/β hidrolasas y presentan una triada catalítica en una región conservada GXSXG de la secuencia proteica que constituye el sitio activo de la enzima. Estas enzimas participan en la degradación de xenobióticos, respuesta a estrés biótico, así como en la producción de compuestos volátiles. Durante la maduración de la fresa, se ha determinado que se produce un incremento de la emisión de compuestos volátiles aunque tan sólo dos alcohol-acil-transferasas (AATs) han sido descritas en relación con su síntesis. Ninguna CXE relacionada con este proceso ha sido caracterizada en fresa hasta ahora, lo que deja abierta su posible participación en dicha biosíntesis durante la maduración del fruto. Los estudios transcriptómicos realizados previamente en nuestro grupo de investigación nos permitieron comprobar que FaCXE2 estaba relacionado con el proceso de maduración y que su expresión se restringía específicamente a fruto. Además, se comprobó que su expresión estaba regulada positivamente por ABA y negativamente por auxinas. Mediante estudios de localización subcelular, se comprobó que la enzima FaCXE2 se encuentra en el citoplasma, al igual que otras enzimas relacionadas con la producción de volátiles. En este sentido y para comprobar su función, se determinó la actividad enzimática de la proteína FaCXE2 recombinante lo que nos permitió comprobar que esta enzima muestra mayor afinidad como sustrato por ésteres de cadena más larga. En paralelo, se procedió al silenciamiento transitorio de la expresión de FaCXE2 mediante agroinfiltración de frutos de fresa con Agrobacterium conteniendo la construcción FaCXE2-RNAi. Los frutos con mayor nivel de silenciamiento fueron seleccionados para determinar su concentración de volátiles. Este análisis nos permitió observar una disminución de la concentración de ésteres y un incremento de la de alcoholes en los frutos transgénicos frente a frutos control. Por tanto, el resultado de la actividad in vitro de FaCXE2 junto con la acumulación de ésteres en los frutos transgénicos sugieren que esta enzima juega un papel determinante en la concentración de ésteres durante la maduración del fruto de fresa.