Interacciones multitróficas reguladas por hongos entomopatógenos para la protección sostenible de cultivos

Abstract

El empleo de ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AME) para el control de plagas de insectos es objeto de un gran interés en tiempos recientes. El principal modo de acción de los AME es el del contacto directo a través del tegumento del insecto, lo que ha propiciado el desarrollo de un amplio abanico de bioinsecticidas (micoinsecticidas) que actúan por contacto. Sin embargo, estos hongos cuentan con un modo de acción secundario asociado a una función ecológica descrita en el siglo XXI que alberga un notorio potencial en protección de cultivos, su condición endófita, que consiste en la ingestión por parte del insecto de tejidos de la planta colonizados por el agente fúngico de control biológico, que complementa al anterior y brinda un grado de control adicional. Asimismo, se están explorando nuevos horizontes de aplicación de estos hongos (ya sea por contacto o por vía endofítica), lo que incluye su uso conjunto con enemigos naturales, depredadores y parasitoides, con objeto de definir estrategias innovadoras de manejo integrado. Por otro lado, algunos AME pueden desempeñar papeles relacionados con la protección de cultivos más allá del control de insectos fitófagos, donde destaca el antagonismo frente a organismos fitopatógenos. De esta forma, la aplicación de AME en campo podría no solo controlar eficazmente las plagas de insectos, sino proporcionar, además, cierta protección frente a enfermedades de cultivos. La presente tesis explora el potencial de cepas endófitas de hongos entomopatógenos para el control de plagas, con énfasis en el impacto de este nuevo modo de acción sobre las relaciones tritróficas insecto-planta-enemigo natural entomófago, así como su posible acción dual para proteger a la planta frente a microorganismos fitopatógenos. En el primer caso, se ha evaluado el empleo conjunto de la cepa endófita EAMa 01/58-Su del AME Metarhizium brunneum (Petch) (Hypocreales: Clavicipitaceae) y del himenóptero endoparasitoide Hyposoter didymator (Thunberg) (Hymenoptera: Ichneumonidae) para el control de la rosquilla negra, Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae), de acuerdo con los dos modos de acción descritos. Este noctuido es uno de los insectos fitófagos más nocivos y ubicuos de toda la cuenca mediterránea, donde origina de manera recurrente severas plagas en cultivos de enorme importancia económica. La literatura científica provee evidencias de la aptitud de ambos agentes, la cepa EAMa 01/58-Su y el referido parasitoide, para el control de S. littoralis, si bien no se ha incidido en su aplicación simultánea. Por ello, se han diseñado diferentes estrategias de aplicación combinada para el control de “la rosquilla negra” tanto en experimentos de laboratorio como in planta, para dilucidar las posibles interacciones multitróficas derivadas de la conjunción de la planta, el entomopatógeno, el fitófago y el enemigo natural entomófago. Los resultados de esta primera línea se presentan en los capítulos II y III. En la segunda línea de la tesis, se ha profundizado en el potencial de cinco cepas de los AME M. brunneum (EAMa 01/58-Su, EAMb 01/158-Su y EAMb 09/01-Su) y Beauveria bassiana Bals. (Vuill) (Hypocreales: Clavicipitaceae) (EABb 01/33-Su y EABb 04/01-Tip) frente a importantes patógenos de girasol. En concreto, los patógenos objeto de estudio fueron los hongos de suelo Verticillium dahliae Kleb. y Cadophora helianthi (L. Molinero-Ruiz, A. Martin-Sanz, C. Berlanas and D. Gramaje), cuyo control en campo se halla amenazado por la aparición de nuevas razas en el primer caso y por la ausencia de alternativas para su control en el segundo, y el oomiceto Plasmopara halstedii Farl. Berl. & de Toni, agente causal del mildiu de girasol, cuyo manejo está condicionado por la aparición de poblaciones resistentes a las materias activas registradas para uso contra este patógeno y por la identificación de nuevas razas de mayor virulencia. Específicamente, se evaluó el antagonismo de los AME frente a V. dahliae y C. helianthi mediante la técnica del cultivo dual y la reducción de síntomas de verticilosis en plantas de girasol tratadas con los AME en condiciones de invernadero. El efecto de los AME sobre P. halstedii se estudió en cultivo axénico durante 14 días, periodo máximo durante el que las plántulas pudieron crecer en este sistema in vitro que limita su desarrollo fenológico completo. Para ello, se evaluaron los síntomas de mildiu expresados por las plántulas y se analizó el efecto que ejercieron las cepas de AME sobre el crecimiento del girasol durante este limitado periodo de tiempo. Adicionalmente, se estudió el perfil racial de las poblaciones de P. halstedii presentes en España y otros países europeos en los últimos años. Los resultados concernientes a esta segunda línea se exponen a lo largo de los capítulos IV y V. En el capítulo II se incidió en la compatibilidad entre H. didymator y la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum en condiciones de laboratorio. Se estudiaron los efectos directos e indirectos derivados de la aplicación directa del AME en adultos del parasitoide mediante pulverización de los mismos con suspensiones de conidios. Aunque el tratamiento fúngico por contacto directo a dosis elevadas, escenario que supera las peores condiciones posibles en pleno campo, redujo de manera significativa la esperanza de vida del parasitoide con mortalidad algo superior al 60%, no tuvo efecto sobre su potencial reproductivo durante los días que siguieron a la inoculación. Asimismo, se evaluaron dos estrategias de aplicación simultánea del hongo y el parasitoide para el control de S. littoralis, exposición al hongo de manera previa al parasitoide y viceversa, con diferentes intervalos de aplicación de cada agente. Las dos estrategias resultaron adecuadas para el control del noctuido, evidenciando la compatibilidad de ambos agentes de biocontrol al tener su empleo conjunto efecto aditivo en todas las estrategias y combinaciones. No obstante, se observó una disminución significativa en el potencial reproductivo de los parasitoides de la siguiente generación emergidos a partir de las larvas de S. littoralis tratadas con el hongo respecto a los emergidos de larvas no tratadas de la misma generación. Además, se constató que el parasitismo de H. didymator ocasiona una reducción en el número de hemocitos presentes en la hemolinfa de las larvas de S. littoralis, una depresión del sistema inmune de los individuos parasitados con impacto en una mayor proporción de larvas diagnosticadas con crecimiento fúngico. Por último, las hembras de H. didymator evidenciaron una preferencia significativa por aquellas larvas de S. littoralis no tratadas con hongo en ensayos de elección junto a larvas inoculadas con el entomopatógeno. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este capítulo ponen de manifiesto la elevada compatibilidad entre la cepa EAMa 01/58-Su y el parasitoide H. didymator, a pesar de los efectos derivados del contacto directo del hongo con el himenóptero. Se ha demostrado la eficacia de su aplicación combinada para controlar a la rosquilla negra, abriendo puertas a los experimentos desarrollados en el capítulo III. En el capítulo III se ha explorado la vía endofítica de la cepa EAMa 01/58-Su, así como la del contacto, en sistemas tritróficos con plantas de melón pulverizadas con suspensiones de conidios del entomopatógeno. Las plantas tratadas, que fueron colonizadas endofíticamente por el AME, se ofrecieron como única fuente de alimento a larvas S. littoralis en experimentos tanto in vitro como in vivo. Asimismo, las larvas se expusieron a adultos de H. didymator en diferentes intervalos de tiempo. Se evaluó la colonización endofítica de las plantas 48 h después del tratamiento, que alcanzó porcentajes muy altos (≈90%) en todos los bioensayos, lo que pone de manifiesto la destacada propiedad endófita de la cepa EAMa 01/58-Su. La inclusión del parasitoide afectó significativamente la mortalidad de S. littoralis; de hecho, aquellos tratamientos en los que las larvas del noctuido se expusieron al parasitoide registraron los mayores porcentajes de mortalidad en los ensayos in vitro e in planta. Sin embargo, la exposición simultánea al hongo y el parasitoide en los diferentes sistemas multitróficos no aumentó la mortalidad de S. littoralis respecto a los tratamientos en los que las larvas únicamente se ofrecieron al parasitoide. Por otro lado, el tiempo de exposición al hongo y al parasitoide no tuvo ningún efecto sobre la mortalidad de S. littoralis, sobre los ratios de parasitismo ni tampoco sobre la proporción de larvas con micosis. Al igual que en el capítulo II, se evaluó la preferencia del parasitoide por larvas expuestas al AME, si bien en el capítulo III se alimentó a las larvas del noctuido con hoja de melón colonizada endofíticamente, en lugar de efectuar un tratamiento directo de las larvas con el entomopatógeno. Como en el capítulo II, las hembras del parasitoide evidenciaron una inequívoca predilección por las larvas que no habían sido expuestas al hongo. Finalmente, se llevó a cabo un estudio histológico en el que se examinaron larvas de S. littoralis expuestas conjuntamente a H. didymator y el entomopatógeno a fin de determinar la posible existencia de relaciones intrahospedante y observar el desarrollo de ambos agentes de biocontrol en el interior del noctuido. Las micrografías presentadas muestran, por primera vez, la coexistencia de los dos agentes dentro del hospedante y el desarrollo de la larva del parasitoide a pesar de la infección fúngica. Los resultados presentados ponen de manifiesto la compatibilidad entre H. didymator y M. brunneum en sistemas in planta, sentando las bases de futuras estrategias de aplicación simultánea para controlar a la rosquilla negra en el campo o en invernadero. En el capítulo IV se investigó el efecto de dos cepas de B. bassiana (EABb 01/33-Su y EABb 04/01-Tip) y tres de M. brunneum (EAMa 01/58-Su, EAMb 09/01-Su y EAMb 01/158-Su) frente a los hongos de suelo causantes de marchiteces de girasol V. dahliae y C. helianthi. Los cinco AME inhibieron significativamente el crecimiento miceliar de los fitopatógenos en cultivo dual en medio de cultivo agar extracto de malta. Los porcentajes de inhibición oscilaron entre el 8.3 y el 63.5% en el caso de V. dahliae, y entre el 19.6 y el 37.4% en el de C. helianthi. Esta inhibición dependió tanto de la cepa del AME como del aislado del patógeno en los cultivos duales con V. dahliae, pero solo de la cepa del AME en los cultivos con C. helianthi. La cepa EABb 01/33-Su de B. bassiana presentó la mayor capacidad inhibitoria frente ambos patógenos. De acuerdo a los cultivos duales y a observaciones al microscopio, los AME ejercieron dos tipos de antagonismo: competición o antibiosis. Sin embargo, mientras que cuatro de los cinco entomopatógenos causaron únicamente uno de los dos antagonismos, la cepa EAMa 01/58-Su (incluida en los capítulos II y III), fue capaz de ejercer ambos, como ya se había descrito con anterioridad. Por otro lado, dos de los AME (EABb 01/33-Su y EAMb 09/01-Su) redujeron significativamente la severidad de los síntomas de verticilosis en plantas de girasol cultivadas en invernadero (severidades de 31 y 53%, respectivamente, en comparación con 95% en las plantas control inoculadas con V. dahliae pero no tratadas con AME). Los AME persistieron en el sustrato durante al menos dos meses tras el tratamiento, a excepción de la cepa EABb 04/01-Tip, que no pudo recuperarse del sustrato más allá de la séptima semana. Por último, los cinco AME se detectaron molecularmente en las plantas al final del experimento (dos meses después de haber sido aplicados al suelo). Curiosamente, solo se detectaron molecularmente en aquellas plantas tratadas con AME pero no inoculadas con V. dahliae, lo que sugiere que la inhibición del hongo fitopatógeno por parte del AME tiene lugar en el suelo y, como consecuencia, la subsiguiente colonización de la planta por V. dahliae se reduce. En el capítulo V se ha abordado el manejo del mildiu de girasol desde una doble perspectiva, esto es, resistencia genética y control biológico. En la primera aproximación se han obtenido datos actualizados acerca del perfil racial de las poblaciones de P. halstedii presentes en España y, en menor grado, Francia, Italia, Portugal y Rumanía, en los últimos años. El método empleado para ello, basado en la reacción de nueve líneas diferenciales de girasol a la inoculación con el patógeno, permitió la identificación de 23 razas diferentes en Europa, de las cuales 22 se confirmaron en España, siendo las razas 310, 304, 705 y 715 más frecuentes que el resto. No solo la diversidad racial de P. halstedii fue mayor que en años anteriores, sino también la presencia de razas altamente virulentas. Por otro lado, se evaluó el efecto de las cinco cepas de AME sobre la severidad de la enfermedad en plántulas de girasol y sobre el desarrollo de estas en cultivo axénico solo durante los primeros 14 días, dado el carácter limitante de este cultivo in vitro para el desarrollo vegetal. Ninguna de las cepas de AME redujo de manera significativa la severidad ni afectó al crecimiento de las plantas durante las dos semanas estudiadas, cuando estas se trataron e inocularon, respectivamente, con ambos organismos. Cuando las plantas se trataron solo con los AME, se observaron para la cepa EABb 01/33-Su y, en menor medida, otras dos, las pautas características de evolución de su desarrollo asociadas al establecimiento del endófito. Finalmente, se obtuvieron porcentajes variables de aislamiento de los AME a partir de las plántulas, si bien la detección molecular de los entomopatógenos solo resultó posible en algunas cepas y únicamente en ausencia de P. halstedii, lo que revela que el método empleado no favorece la acción de los entomopatógenos ni es el más adecuado para la colonización endofítica. En conclusión, la presente tesis doctoral incide en los mecanismos subyacentes tras las interacciones que tienen lugar en sistemas multitróficos que incluyen plantas, agentes de control biológico macrobianos y microbianos y organismos fitófagos o fitopatógenos. El AME M. brunneum posee un destacable potencial para su aplicación conjunta con el parasitoide H. didymator en distintas condiciones. Adicionalmente, las cinco cepas de M. brunneum y B. bassiana, y en particular EABb 01/33-Su y EAMb 09/01-Tip, han resultado ser candidatos muy prometedores para el manejo de algunos hongos patógenos de girasol a la luz del antagonismo in vitro frente a V. dahliae y C. helianthi y, sobre todo, de la reducción de la severidad de la verticilosis en girasol. No obstante, debe profundizarse en el empleo de los AME para el control del mildiu, puesto que no se ha evidenciado un efecto positivo sobre la severidad de dicha enfermedad en cultivo axénico en las condiciones experimentales utilizadas. Finalmente, los cinco entomopatógenos mostraron una aptitud endofítica muy marcada en girasol (en el caso de la cepa EAMa 01/58-Su, también en melón). La profundización en estas líneas de investigación contribuirá a definir estrategias de aplicación de los AME en el campo como parte de sistemas de gestión integrada de plagas.

The use of entomopathogenic mitosporic ascomycetes (EMA) for pest control has received increased attention in the last years. The main mode of action of EMA is via direct contact through the insect integument, which has led to the development of a wide variety of contact bioinsecticides (mycoinsecticides) around the world. However, an alternative mode of action of these EMA related to their new ecological role as endophytes has been described in the XXI century. Indeed, feeding of insect pest on endophytically colonised plant tissues may cause an additional insect mortality that improves the outcome of foliar applications of EMA against chewing. Moreover, strategies including joint use of EMA (either by direct contact or via endophytism) and macrobial biocontrol agents (i.e., predators and parasitoids) are being considered as promising alternatives within IPM programs. On the other hand, EMA may play other roles linked to plant protection in the frame of these new ecological roles, such as the protection of the plant against plant pathogens. Thus, these fungi may provide certain levels of disease control while effectively controlling insect pests. In this way, the present thesis explores the potential of endophytic strains of entomopathogenic fungi for pest control, with emphasis on the impact of this new mode of action on the tritrophic insectplant- entomophagous natural enemy relationships, as well as its possible dual action to protect the plant against phytopathogenic microorganisms. Regarding the former, simultanous use of an endophytic strain of the EMA Metarhizium brunneum (Petch) (Hypocreales: Clavicipitaceae) (EAMa 01/58-Su) and the hymenopteran endoparasitoid Hyposoter didymator (Thunberg) (Hymenoptera: Ichneumonidae) to control the cotton leafworm, Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) under different conditions has been explored. This noctuid is one of the most noxious polyphagous widespread insect pests in the Mediterranean basin, causing economic losses to several crops of great economic importance. Both EAMa 01/58-Su strain and the parasitoid have been proved to be suitable candidates for controlling S. littoralis in previous research, although their combined use has not yet been investigated. Thus, we assessed different strategies to control the cotton leafworm both in laboratory and in planta conditions, delving into multitrophic interactions between plant, pest and natural enemy. The results concerning this line are presented in chapters II and III. In the second line of the thesis, it has been investigated the potential of five strains of the EMA M. brunneum (EAMa 01/58-Su, EAMb 01/158-Su and EAMb 09/01- Su) and Beauveria bassiana Bals. (Vuill) (Hypocreales: Clavicipitaceae) (EABb 01/33-Su and EABb 04/01-Tip) against important sunflower pathogens. Specifically, the pathogens were Verticillium dahliae Kleb. and Cadophora helianthi (L. Molinero-Ruiz, A. Martin-Sanz, C. Berlanas and D. Gramaje), two soilborne fungi causing sunflower wilts whose management is threatened by the appearance of populations of increased pathogenicity and by the total absence of control alternatives, respectively. Also the effect of EMA against Plasmopara halstedii Farl. Berl. & de Toni, causal agent of downy mildew of sunflower, was assessed. In this case, the management of the disease is hampered by either fungicideresistant or highly virulent pathogen populations. The antagonism of the EMA against V. dahliae and C. helianthi was tested in vitro by dual plating, whereas the reduction of verticillium wilt was evaluated in sunflowers treated with the EMA and grown under greenhouse conditions. The effect of AME on P. halstedii was studied in axenic culture for 14 days, the maximum period during which the seedlings could grow in this in vitro system that limits their complete phenological development. Hence, the symptoms of mildew expressed by the seedlings were evaluated and the effect exerted by the AME strains on the growth of sunflower during this limited period of time was analysed. Moreover, we present an updated racial characterization of P. halstedii populations from Spain and other European countries. The results obtained in this line are presented in chapters IV and V. In chapter II, compatibility between H. didymator and M. brunneum EAMa 01/58-Su strain was investigated in laboratory conditions. We studied both direct and indirect effects of the EMA toward parasitoid adults when directly applied by spraying them with conidial suspensions. Although the direct contact fungal treatments at the higher dose significantly reduced the parasitoids’ life expectancy and caused a mortality slightly above 60%, their reproductive potential during the days after treatment was not affected. Furthermore, we evaluated two strategies for simultaneous application of fungus and parasitoid to control S. littoralis (exposure to fungus before parasitoid and vice versa at different releasing times). Both strategies were suitable for controlling this noctuid and showed compatibility between the two biocontrol agents, with additive effect in all combinations. However, we observed a significant reduction on the parasitization capability of the F1 parasitoid generation emerged from fungus-treated S. littoralis larvae compared with parasitoids emerged from non-treated larvae of the same generation. Moreover, we observed that parasitization significantly reduced the number of haemocytes in the haemolymph of S. littoralis larvae, which caused a depletion on the immune system of the parasitized larvae, therefore promoting fungal pathogenesis and fungal outgrowth from the cadavers. Finally, parasitoid females showed a significant preference for non-treated S. littoralis larvae compared with fungus-treated larvae. Therefore, the results obtained in this chapter demonstrated high compatibility between the fungal strain and the parasitoid, despite direct and indirect effects of the fungus on parasitoids via direct contact, as well as a high efficacy of the simultaneous application of both biocontrol agents to control the cotton leafworm. This work opens doors to the experiments performed in chapter III. In chapter III, we explored the impact of the endophytic behaviour of the EAMa 01/58-Su strain on the abovementioned multitrophic interactions. Hence, we sprayed melon plants with conidial suspensions, being subsequently colonized endophytically, and fed S. littoralis larvae on colonized plants in different in vitro and in vivo experiments. In addition, larvae were exposed to H. didymator adults at different releasing times. The sprayed plants were successfully colonized by the EMA within the first hours after fungal treatment in all the experiments, revealing the high endophytic behaviour of this strain. Total mortality of S. littoralis larvae was significantly affected by the presence of the parasitoid. Moreover, all treatments including the parasitoid achieved the highest mortality rates both in vitro and in planta. However, simultaneous exposure to the fungus and the parasitoid did not significantly affect the total mortality of S. littoralis larvae compared with when the parasitoid was used alone. The time between exposure to fungus and parasitoid did not affect S. littoralis mortality, nor parasitism or infection rates in any experiment. As in chapter II, we evaluated the parasitoid’s preference for larvae exposed to the EMA, although in this case larvae were not directly treated, but fed on fungal-colonized plant. As in the previous chapter, parasitoids showed a significant preference for those larvae that had not been exposed to the EMA. Finally, we conducted a histological study of S. littoralis larvae simultaneously parasitized by H. didymator and infected by M. brunneum in order to examine intra-host relationships and observe the development of both biocontrol agents inside S. littoralis. Our micrographs showed, for the first time, the coexistence of both agents within the same host and the development of H. didymator larvae despite fungal colonization of S. littoralis. Our findings provide key information on compatibility between H. didymator and M. brunneum in in planta systems, what is a first step to deploy sustainable IPM programs for controlling the cotton leafworm at field and greenhouse conditions. In chapter IV, the effect of two B. bassiana strains (EABb 01/33-Su and EABb 04/01-Tip) and three strains of M. brunneum (EAMa 01/58-Su, EAMb 09/01-Su and EAMb 01/158-Su) against the soilborne pathogens causing sunflower wilt V. dahliae y C. helianthi, was investigated. The five EMA were able to significantly inhibit the mycelial growth of both V. dahliae and C. helianthi when dually plated onto malt extract agar medium. The inhibition ranged from 8.3 to 63.5% in the case of V. dahliae, and from 19.6 to 37.4% in C. helianthi. Percentages of inhibition were dependent on both the EMA and the pathogen isolate in dual cultures with V. dahliae, whereas they were only dependent on the EMA in the case of C. helianthi. EABb 01/33-Su strain was the most effective antagonist against both pathogens. According to the dual cultures and microscopic examinations, two types of antagonism were exerted by the EMA: competition or antibiosis. Whereas most of the EMA were associated to only one type of antagonism, EAMa 01/58-Su strain (included in chapters II and III) was able of exert both, which had been reported in previous research. On the other hand, two EMA (EABb 01/33-Su and EAMb 09/01-Su) significantly inhibited the severity of verticillium wilt symptoms in sunflowers grown in the greenhouse (severities of 31 y 53%, respectively, as compared to 95% in control plants only inoculated with V. dahliae). The EMA were able to persist in the soil for at least two months after treatments, with the exception of EABb 04/01-Tip strain, which persistence reached up to the seventh week. Finally, the five EMA were molecularly detected inside the sunflowers at end of experiments (two months after application to soil), showing that their endophytic ability can exceed the transient period of plant colonization that has been reported for these fungi. Interestingly, the EMA only were molecularly detected inside the sunflowers in treatments with EMA not inoculated with V. dahliae. This finding suggests that the inhibition of V. dahliae by EMA occurs in the soil and, as a consequence, subsequent colonization of sunflower by the pathogen is reduced. In chapter V, the management of downy mildew of sunflower was explored from two perspectives: genetic resistance and biological control. On the one hand, we present an updated racial characterization of P. halstedii populations from Spain, France, Italy, Portugal and Romania. The races were assigned by means of the response of nine sunflower differential lines to inoculation with each of the pathogen populations. Twenty-three races were identified in Europe, whereas twenty-two of them were detected in Spain. The most frequent races were 310, 304, 705 and 715. The variety of races of P. halstedii was wider than in previous years, whereas we identified a high number of highly virulent ones. On the other hand, the effect of the five EMA strains on the severity of the disease in sunflower seedlings and on their development in axenic culture was evaluated only for 14 days, given the limitations of this in vitro culture for plant development. None of the EMA strains significantly reduced the severity or affected the growth of the plants during the two weeks studied, when they were treated and inoculated, respectively, with both organisms. When the plants were inoculated only with EMA strains, the characteristic growth developmental patterns associated with the establishment of the endophyte were detected in plants treated with EABb 01/33-Su and, to a lesser extent, other two fungal strains. Although the EMA were isolated from plants in different percentages, they were molecularly detected only when they were applied without P. halstedii. Our results suggest that the assayed conditions were not suitable for the endophytic colonization of plants by EMA nor for the infection by P. halstedii. In conclusion, the present thesis delves into the mechanisms underlying multitrophic interactions in systems including plants, macro- and/or microbial biological control agents and plant pests or pathogens. The EMA M. brunneum has shown a remarkable potential to be simultaneously applied with H. didymator under different conditions. Furthermore, the five strains of the EMA M. brunneum and B. bassiana, particularly EABb 01/33-Su and EAMb 09/01-Tip, are promising candidates to control some sunflower pathogens due to their in vitro antagonism against V. dahliae and C. helianthi and, above all, to the reduced severity of verticillium wilt when they were applied to sunflowers. However, the potential of EMA against downy mildew of sunflower must be thoroughly studied. In axenic culture, none of the tested EMA showed any effect on the severity of symptoms by P. halstedii. Finally, the five EMA showed a lasting endophytic property in sunflower and EAMa 01/58-Su also in melon. However, further research will elucidate possible strategies for application of these EMA in the field as part of IPM programs.