Vitrification as an alternative to conventional techniques of stallion sperm cryopreservation

Abstract

The development of cryopreservation has been crucial for the maintenance of animal genetic resources and the improvement of reproductive efficiency. Kinetic sperm vitrification has been developed mainly as an alternative to conventional freezing. It is based on the direct immersion in liquid nitrogen (LN2) of a sperm suspension without permeable cryoprotectants (CPAs), being one of its main advantages the reduction of cellular damage due to the absence of intracellular ice crystals. Therefore, in the present Doctoral Thesis, different protocols of sperm vitrification have been developed in the equine species, as an alternative method of cryopreservation. In Chapter 1, different concentrations of sucrose were evaluated as an alternative to permeable CPAs for stallion sperm freezing. The addition of 100 mM of sucrose and 1% of bovine serum albumen (BSA) obtained higher values for most of the kinetic sperm parameters evaluated (P<0.001), showing a lower percentage of spermatozoa with damaged acrosome membrane compared to the extender with glycerol (P<0.05). In Chapter 2, the effect of non-permeable CPAs and equilibration temperature on the quality of the spermatozoa after vitrification in spheres was evaluated. Sperm refrigeration at 5ºC and the use of a proper concentration of non-permeable CPAs (20 mM sucrose + 1% BSA) were key factors for stallion sperm vitrification. The objective of Chapter 3 was to vitrify large volumes of stallion sperm using 0.5 mL straws, and the assessment of different warming procedures (42°C / 20s; 60°C / 15s) and single layer centrifugation (SLC). The warming procedures of vitrified samples did not improve the quality of the sperm. However, SLC technique could be a strategy to enhance the quality of the samples of sperm vitrified in large volumes, since higher values of sperm motility and plasma membrane integrity were obtained with this technique. Nevertheless, the sperm quality obtained after vitrification in 0.5 mL straws was lower than after vitrification in spheres. Chapter 4 was designed with the objective of developing the vitrification technique for stallion sperm using 0.25 mL straws. Thus, it was observed that the use of 0.25 mL straws filled with 100 μl and 100 x 106 spermatozoa/mL using an extender containing 100 mM trehalose and 1% BSA was the optimal method of stallion sperm vitrification. This vitrification method obtained higher values in comparison to conventional freezing for progressive motility (48.2 ± 2.3% vs. 37.3 ± 2.2%), integrity of plasma (82.8 ± 1.5% vs. 74.1 ± 1.9%) and acrosome membrane (50.2 ± 1.2% vs. 43.1 ± 1.4%), as well as less DNA fragmentation (6.4 ± 0.7% vs. 8.2 ± 0.3%). Likewise, the supplementation of the vitrification extender with 0.25% low-density lipoprotein (LDL) and 1% Pronexcell improve the quality of the sperm after vitrification. In Chapter 5, the objective was to assess the fertilizing capacity of frozen or vitrified stallion sperm. Firstly, it was demonstrated that warming vitrified straws in a water bath at 60ºC / 5s can be used as an alternative to the conventional warming method, by immersion in a pre-warmed extender at 43ºC. Subsequently, the fertilizing capacity of the vitrified and frozen sperm was evaluated using heterologous IVF procedures, using cattle oocytes. Vitrification resulted in greater values (P <0.05) than freezing for the number of bound sperm (1.36 ± 0.3 and 0.69 ± 0.2, respectively). There were no differences between frozen or vitrified sperm in pronuclear formation (26h. post-insemination-hpi; 14.08 ± 4.2% and 22.78 ± 4.8%, respectively) or cleavage rate (32.77 ± 4.3% and 39.66 ± 4.6%, respectively). In conclusion, according to the results obtained in this Doctoral Thesis, vitrification of stallion sperm using non-permeable CPAs can be used as an alternative to conventional sperm freezing.

El desarrollo de la criopreservación de esperma ha sido crucial para la conservación de recursos genéticos animales y la mejora de la eficiencia reproductiva de diferentes especies. La vitrificación cinética del esperma es una técnica que se ha desarrollado recientemente como alternativa a los métodos de criopreservación convencional. Se basa en la inmersión directa en nitrógeno líquido de una suspensión de espermatozoides sin crioprotectores (CPAs) permeables, siendo una de sus principales ventajas la reducción del daño celular debido a la ausencia de cristales de hielo intracelulares. Por tanto, en la presente Tesis Doctoral se han desarrollado distintos protocolos de vitrificación espermática en la especie equina, como método alternativo de criopreservación. En el Capítulo 1, se evaluó el empleo de distintas concentraciones de sacarosa como alternativa a los crioprotectores permeables para la congelación de esperma de caballo. La adición de 100 mM de sacarosa y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) obtuvo valores mayores para la mayoría de los parámetros cinéticos espermáticos evaluados (P <0,001), mostrando un porcentaje de espermatozoides con membrana acrosómica dañada inferior en comparación con el diluyente con glicerol (P <0,05). En el Capítulo 2, se evaluó el efecto de los CPAs no permeables y de la temperatura del periodo de equilibrado sobre la calidad de los espermatozoides tras la vitrificación en esferas. La refrigeración a 5ºC y el empleo de una adecuada concentración de CPAs no permeables (20 mM de sacarosa + 1% de BSA) fueron factores clave para la vitrificación de esperma de caballo. El Capítulo 3 tuvo como objetivo la vitrificación de grandes volúmenes de esperma de caballo, empleando pajuelas de 0,5 mL, y la evaluación de diferentes procedimientos de calentamiento (42ºC / 20s; 60ºC / 15s) y de la centrifugación en una sola capa de coloide (SLC). Los procedimientos de calentamiento de las muestras vitrificadas no mejoraron la calidad de los espermatozoides. Sin embargo la técnica SLC podría ser una estrategia para mejorar la calidad de las muestras vitrificadas en grandes volúmenes, ya que tras esta se obtuvieron valores más altos de movimiento espermático e integridad de la membrana plasmática. En cualquier caso, la calidad de las dosis vitrificadas en pajuelas de 0,5 mL fue inferior a la obtenida tras la vitrificación en esferas. El Capítulo 4 fue diseñado con el objetivo de optimizar la técnica de vitrificación de esperma de caballo, empleando pajuelas. Así, se observó que pajuelas de 0,25 mL con un volumen de esperma de 100 μl, a una concentración de 100 x 106 espermatozoides/mL y utilizando un diluyente que contenía 100 mM de trehalosa y 1% de BSA resultó ser el método óptimo para la vitrificación de esperma de caballo. Este método de vitrificación obtuvo valores mayores en comparación con la congelación convencional para el movimiento progresivo (48,2 ± 2,3% vs. 37,3 ± 2,2%), integridad de la membrana plasmática (82,8 ± 1,5% vs. 74,1 ± 1,9%) y del acrosoma (50,2 ± 1,2% vs. 43,1 ± 1,4%), así como menor fragmentación del ADN (6,4 ± 0,7% vs. 8,2 ± 0,3%). Asimismo, la suplementación del diluyente de vitrificación con 0,25% de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y 1% de Pronexcell, mejoró la calidad de los espermatozoides tras la vitrificación. En el Capítulo 5, se valoró la capacidad fecundante de los espermatozoides de caballo congelados o vitrificados. En primer lugar, se demostró que el calentamiento de pajuelas vitrificadas en un baño de agua a 60ºC/5s puede ser empleado como alternativa al método convencional mediante inmersión en diluyente a 43ºC. Posteriormente, se evaluó la capacidad fecundante de los espermatozoides vitrificados y congelados mediante la técnica de la fecundación in vitro (FIV) heteróloga, utilizando ovocitos de bovino. La vitrificación resultó en valores mayores (P <0,05) que la congelación para el número de espermatozoides unidos a los ovocitos (1,36 ± 0,3 y 0,69 ± 0,2, respectivamente). No hubo diferencias entre los espermatozoides congelados o vitrificados en la formación de los pronúcleos (26 h después de la inseminación - hpi; 14,08 ± 4,2% y 22,78 ± 4,8%, respectivamente) o la tasa de segmentación de embriones (32,77 ± 4,3% y 39,66 ± 4,6%, respectivamente). En conclusión, de acuerdo con los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, la vitrificación de esperma de caballo empleando crioprotectores no permeables, puede ser una técnica alternativa a la congelación convencional de esperma.