Studies of variability in the response of holm oak (Quercus ilex L.) to stresses associated with the decline syndrome: Drought and Phytophthora cinnamomi

Abstract

Resilience to adverse environmental conditions (biotic and abiotic stresses) is one of the main objectives in forest tree breeding programs, and it should be a priority for Holm oak (Quercus ilex), considered the increasing mortality of individuals associated to the decline syndrome and the predicted in a climate change scenario. As a non-domesticated species and considering its biological characteristics (long-lived, allogamous, wind-pollinated), the only plausible strategy in Holm oak breeding programs is the selection of resistant and tolerant elite genotypes for clonal propagation and ulterior use in reforestation. Elite or plus genotype trees can be characterized and identified at the morphological, physiological, and molecular (nucleic acids, proteins, and metabolites) levels. The research and characterization of the molecular mechanisms and genes implicated in the response and resilience to stresses will favour the selection of elite genotypes at early stages of the biological cycle, thus speeding breeding programs. In this direction, the present Thesis was planned, which aimed at studying the effect and response to individual and/or combined, drought and Phytophthora cinnamomi (root rot), stresses in Holm oak. Both stresses constitute the main factors of the decline syndrome and supposed to be one of the main causes of tree mortality in a climate change scenario. The experiments were performed with seedlings from populations representatives of the different Andalusian provenances. They were subjected to drought stress under high temperature and irradiation (chapter 2 and 3) or to a combination of drought and P. cinnamomi inoculation (chapter 4). The effect and the response to stresses was evaluated at different levels: i) Morphological: growth, damage symptoms, and seedling dead (Chapters 2 and 4). ii) Physiological: water content, and photosynthesis (Chapters 2 and 4). iii) Biochemical: pigments, sugars, amino acids, phenolics, and flavonoids content (Chapters 2 and 4). iv) Omics: proteomics (Chapters 3 and 4). From the data on damage symptoms and plant mortality, phenotypic differences (tolerance, resistance, susceptibility) between species, populations and individuals were observed. According to physiological, biochemical, and proteomics data, mechanisms of tolerance and resistance are proposed. From the proteomics data gene products related to the resilient character are identified, with some of the proteins and derived peptides proposed as molecular markers of resilience. Quercus ilex intra- and interpopulation phenotypic variability in the response to the studied stresses has been found with differences based on the percentage of damaged and dead seedlings. This percentage should be used as an indicator of the response to drought and P. cinnamomi. Under drought conditions, the Eastern populations (Jaen and Granada) showed a lower damage and mortality than the Western ones (Cadiz, Cordoba, and Seville), being characterized as the most tolerant. The combined effects of the P. cinnamomi attack and drought stress were more damaging than the effects of pathogen attack or drought stress alone for three populations tested (Seville, Granada, and Almeria), being more severe in Almeria, Eastern population, an area in which the presence of the pathogen has not been constated yet. Granada population showed a better response to the individual and combined stresses, being the population with higher number of surviving seedlings, and supposed to be the most resilient to the decline syndrome. Different leaf physiological parameters related to water regime and photosynthesis activity have been measured, including relative leaf water content (RLWC), leaf fluorescence and derived PS II quantum yield at darkadapted state (Qy), net photosynthesis and stomatal conductance. These parameters have been widely utilized in the study of seedling responses to stresses and taken as an estimation of tolerance and resistance in Q. ilex and other Quercus species. Although RLWC decreased in response to drought to different degrees depending on the individual and population (the Eastern populations showed a higher RLWC that the Western ones), Q. ilex seedlings kept leaf tissue well hydrated, with values above 40% in tolerant individuals. Similar results were obtained in the combined drought and P. cinnamomi treatment, although the reduction of RLWC was more accused in the combined stress. Tolerant individuals kept RLWC and turgor above a threshold value of 40%, being one of the key responses to water deprivation stresses. Under stress conditions, a reduction in photosynthetic activity was observed as indicated by the decrease in the Qy parameter. The decrease was dependent on the stress conditions, duration, and population, being maximum in the combined drought and P. cinnamomi treatments, and for the Almeria population. Stomatal closure is a strategy used to diminish water transpiration, prevent leaf water potential, and avoid xylem cavitation under unfavourable conditions. Therefore, stomatal conductance and net photosynthesis were diminished under drought and/or P. cinnamomi treatments. The effect observed in Q. ilex was also stress-, duration- and population-dependent. The difference in drought response between Western and Eastern populations deduced from the previous parameters discussed above was not observed while using the stomatal conductance and net photosynthesis parameters. Cadiz population, where most dead seedlings were observed under drought conditions, correlated with the lowest RLWC and the highest stomatal conductance, thus suggesting it to be the most susceptible population among the ones studied. The content of chlorophylls, carotenoids, amino acids, starch, sugars, phenolics and flavonoids was quantified in control and stressed, nondamaged, seedlings at the end of the experiment (25 and 32 days for the drought and combined stress experiments respectively). In general, photosynthetic pigments remained unchanged under stressing conditions, being in the range of those corresponding to control seedlings, indicating that the photosynthetic molecular machinery was not affected. An increase in the content of sugar, amino acids and total phenolics was observed under drought conditions, which is expected in those tolerant species prone to drought. In the P. cinnamomi or combined stress experiment, neither amino acid nor phenolic content was modified, indicating that the response was stress dependent. On the contrary, sugar, flavonoids and starch were increased in inoculated and combined seedlings. Metabolic homeostasis and reorganization of the pathways, from autotrophic to heterotrophic routes, and the increase of stress related (antioxidants, osmotic active compounds) is proposed as a general response to the treatments, with particularities for biotic and abiotic stresses, and with no qualitative, but quantitative ones, differences among provenances and individuals. The last level of study was the proteomics analysis of the changes in the leaf protein profile in response to individual or combined stresses. It had a double objective, the first one related to the identification of mechanisms and gene products related to the stress-resilient character, and the second one focussed on the proposal of protein markers to be used in the identification of elite genotypes. For that, a triple strategy was used: gel-based, gel-free or shotgun, and targeted post-acquisition data analysis. Changes in the protein profiles were stress- and individual-dependent, with general tendencies for the different and populations. Variable proteins belonged to photosynthesis, starch, sugar and phenolic metabolism, protein fate, stress-related, and transport. When analysing the functional groups of variable proteins, a general tendency was found, in which an accumulation of stress- and defense-related proteins, antioxidant and phenolic pathway enzymes, and a reduction of those of photosynthesis was observed. While photosynthetic enzymes were almost not affected under drought conditions, they were less abundant in the combined stress. Proteomics data on starch metabolic enzymes under drought conditions were apparently contradictory, as there were up- and down-accumulated proteins. It may be related to the presence of different types of starch, whether permanent or transitory and that of isoforms involved in their synthesis and mobilization. Key enzymes of the shikimate–phenolic biosynthetic pathways (chalcone synthase and 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase) were more abundant under drought conditions. Within the protein fate group, synthesis (ribosomal and transcription) was the most represented, showing qualitative and quantitative changes, followed by folding and degradation categories. In general, under adverse conditions, an increase in stress-related proteins was observed, including redox, antioxidant enzymes, and drought and pathogen responsive. A panel of 30 proteins and 46 derived peptides, increased in response to drought in at least two out of the four populations surveyed are proposed as markers for this conditions, they belonging to redox, stress-related, synthesis, -folding and degradation, and primary and secondary metabolism functional groups. Two of them, subtilisin and chaperone GrpE were found at increased levels in three populations, which make them especially interesting for validation in subsequent experiments. Out of the total variable proteins found in the combined stress experiment, four are proposed as putative markers of resilience, including an aldehyde dehydrogenase, glucose-6-phosphate isomerase, 50S ribosomal protein L5, and alpha-1,4-glucan-protein synthase [UDP-forming]. Despite the advances in the knowledge of the molecular mechanisms behind the resilience to drought and P. cinnamomi generated in the present Thesis, and considering the high variability found in Q. ilex, it is important to remind that the proposed mechanisms and markers must be functionally validated by reverse genetics strategies and confirmed for a higher number of populations and individuals before being considered as general for Q. ilex. The next step will be to understand the genetic and epigenetic bases of the resilience and the differences between genotypes. In this direction, the recent sequencing of the Q. ilex genome carried out in the group will be a key milestone.

La resiliencia a condiciones ambientales adversas (estreses bióticos y abióticos) es uno de los principales objetivos de los programas de Mejora Forestal, siendo una prioridad para la encina (Quercus ilex), teniendo en cuenta la creciente mortalidad de individuos asociados al Síndrome de la Seca y las previsiones de Cambio Climático. Como especie no domesticada y considerando sus características biológicas (longeva, alógama y polinizada por el viento), la única estrategia plausible en un programa de mejora de la encina es la selección de genotipos élite resistentes y tolerantes a estreses para su posterior propagación clonal y su uso en programas de reforestación. Los genotipos élite o plus pueden caracterizarse e identificarse a nivel morfológico, fisiológico y molecular (ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos). La investigación y caracterización de los mecanismos moleculares y genes implicados en la respuesta y resiliencia al estrés favorecerá la selección temprana de genotipos élite, acelerando así los programas de mejora. En este contexto se propuso la presente Tesis, la cual tuvo como principal objetivo estudiar el efecto y respuesta a estreses individuales y/o combinados de sequía y Phytophthora cinnamomi (podredumbre radical) en encinas. Ambos estreses constituyen los principales factores del Síndrome de la Seca y una de las posibles causas de mortalidad de los árboles en un escenario de cambio climático. Los experimentos se realizaron con plántulas de poblaciones de diferentes procedencias andaluzas y fueron sometidos a estrés por sequía en condiciones de temperatura e irradianza elevadas (Capítulo 2) o a una combinación de sequía e inoculación con P. cinnamomi (Capítulo 4). El efecto y la respuesta al estrés se evaluó a diferentes niveles: i) Morfológico: crecimiento, síntomas de daño y mortandad (capítulos 2 y 4). ii) Fisiológico: contenido de agua y fotosíntesis (capítulos 2 y 4). iii) Bioquímico: contenido en pigmentos, azúcares, aminoácidos, fenólicos y flavonoides (capítulos 2 y 4). iv) Ómico: proteómica (capítulos 3 y 4). A partir de los datos de daños y mortalidad, se observaron diferencias fenotípicas (tolerancia, resistencia, susceptibilidad) entre especies, poblaciones e individuos. A partir de los análisis fisiológicos, bioquímicos y proteómicos, se proponen mecanismos de tolerancia y resistencia. La proteómica permitió la identificación de genes relacionados con el carácter resiliente, y la identificación de proteínas y péptidos derivados que pueden ser utilizados como marcadores moleculares de resiliencia. En base al número de plántulas dañadas y muertas, se encontró una variabilidad fenotípica intra e interpoblacional en la respuesta de Q. ilex a los estreses impuestos. El porcentaje de individuos dañados y muertos debe utilizarse como indicador de la respuesta a la sequía y P. cinnamomi. En condiciones de sequía, las poblaciones orientales (Jaén y Granada) presentaron menor daño y mortalidad que las occidentales (Cádiz, Córdoba y Sevilla), caracterizándose como las más tolerantes. Los efectos del estrés combinado, P. cinnamomi y sequía fueron más intensos que el de los estreses individuales, P. cinnamomi o sequía, en las tres poblaciones analizadas (Sevilla, Granada y Almería), siendo la de Almería la más afectada, localizada ésta en una zona donde aún no se ha constatado la presencia del patógeno. La población de Granada mostró una mejor respuesta a los estreses individuales y combinados, siendo la población con mayor número de plántulas vivas, y, por tanto, la más resistente al Síndrome de la Seca. Se han medido diferentes parámetros fisiológicos de las hojas relacionados con el contenido hídrico y la actividad fotosintética, incluyendo el contenido relativo de agua en hoja (RLWC), la fluorescencia y el rendimiento cuántico de PSII en condiciones de oscuridad (Qy), la fotosíntesis neta y la conductancia estomática. Estos parámetros se han utilizado ampliamente en el estudio de las respuestas de las plántulas al estrés y se han tomado como una estimación de la tolerancia y resistencia en Q. ilex y otras especies de Quercus. Aunque el RLWC disminuyó en respuesta a la sequía en diferentes grados según el individuo y la población (las poblaciones del Este mostraron un RLWC más alto que las del Oeste), las plántulas de Q. ilex mantuvieron el tejido foliar bien hidratado, con valores superiores al 40% en individuos tolerantes. Se obtuvieron resultados similares en el tratamiento combinado de sequía y P. cinnamomi, aunque la reducción de RLWC fue más acusado. Los individuos tolerantes mantuvieron el RLWC y la turgencia por encima de un valor umbral del 40%, siendo una de las respuestas clave al estrés hídrico. En condiciones de estrés, se observó una caída en la actividad fotosintética como lo indica la disminución en el parámetro Qy. Dicha caída dependió de las condiciones de estrés, duración y población, siendo máxima en los tratamientos combinados de sequía y P. cinnamomi, y para la población de Almería. El cierre estomático es una estrategia utilizada en condiciones desfavorables para disminuir la pérdida de agua, prevenir la caída en el potencial hídrico y evitar la cavitación del xilema. La conductancia estomática y la fotosíntesis neta disminuyeron con los tratamientos de sequía y/o P. cinnamomi, siendo el efecto, al igual que el de otros parámetros fisiológicos, dependiente del estrés, la duración y la población. La diferencia observada entre las poblaciones occidentales y orientales en respuesta a la sequía deducida de los parámetros anteriores no se observó al estudiar los parámetros de conductancia estomática y fotosíntesis neta. La población de Cádiz presentó el mayor número de plántulas muertas en condiciones de que se correlacionó con el RLWC más bajo y la conductancia estomática más alta, lo que sugiere que es la población más susceptible entre las estudiadas. El contenido en clorofilas, carotenoides, aminoácidos, almidón, azúcares, fenólicos y flavonoides se cuantificó en el tejido foliar de las plántulas control y estresadas, no dañadas, al final del experimento (días 25 y 32 para los experimentos de sequía y estrés combinado respectivamente). En general, los pigmentos fotosintéticos se mantuvieron sin cambios en condiciones de estrés, estando en el rango de los correspondientes a las plántulas control, lo que indica que la maquinaria molecular fotosintética no se vio afectada. Se observó un aumento en el contenido de azúcares, aminoácidos y compuestos fenólicos en condiciones de sequía, tal y como se ha descrito en otras especies tolerantes a sequía. En el experimento de estrés combinado, no se modificó el contenido de aminoácidos ni de compuestos fenólicos, lo que indica que la respuesta molecular dependió del tipo de estrés. Por el contrario, el contenido en azúcares, almidón y flavonoides aumentó en las plántulas inoculadas y sujetas a estrés combinado. Se propone que durante situaciones de estrés la planta activa mecanismos reguladores de la homeostasis metabólica, mediante la reorganización de rutas con disminución y aumento de, respectivamente, rutas autótrofas a heterótrofas, y el aumento de compuestos de respuesta a estreses (antioxidantes, compuestos activos osmóticos). l último nivel de estudio llevado a cabo fue el del análisis proteómico para detectar cambios en el perfil proteico de la hoja en respuesta a estreses individuales o combinados. Tuvo un doble objetivo, el primero relacionado con la identificación de mecanismos y productos génicos relacionados con el carácter resiliente/resistente/tolerante al estrés, y el segundo, la identificación y propuesta de marcadores proteicos para ser utilizados en la identificación de genotipos élite. Para eso, se utilizó una triple estrategia proteómica: basada en gel, libre de gel o shotgun, y dirigida, utilizando péptidos proteotípicos. Los cambios en los perfiles proteicos dependieron del tipo de estrés y del individuo, con tendencias generales para las diferentes poblaciones. Las proteínas variables pertenecieron principalmente a los grupos funcionales relacionados con la fotosíntesis, metabolismo de almidón, azúcares y de compuestos fenólicos, síntesis y degradación de proteínas, transporte y estrés. En situaciones de estrés, se observó como tendencia general un aumento en proteínas relacionadas con el estrés y defensa, enzimas antioxidantes y de la ruta de síntesis de fenólicos. En condiciones de sequía no se vieron cambios apreciables en proteínas y enzimas fotosintéticas; sin embargo, algunas de ellas disminuyeron en condiciones de estrés combinado. Los datos proteómicos sobre las enzimas del metabolismo del almidón en condiciones de sequía fueron aparentemente contradictorios, ya que había proteínas más y menos abundantes. Esta observación puede estar relacionada con la existencia de diferentes tipos de almidón, permanente o transitorio, y de isoformas involucradas en su síntesis y movilización. Las enzimas clave de la ruta del shikimato-fenólicos (chalcona sintasa y 3-fosfosquimato 1-carboxiviniltransferasa) fueron más abundantes en condiciones de sequía. En general, en condiciones adversas, se observó un aumento de proteínas relacionadas con el estrés, incluidas enzimas redox, antioxidantes y de respuesta a sequía y patógenos. Se propone como marcadores de tolerancia a la sequía un panel de 30 proteínas y 46 péptidos derivados, que se vieron incrementadas en respuesta a esta condición en al menos dos de las cuatro poblaciones analizadas. Correspondieron a enzimas antioxidantes, relacionadas con el estrés, síntesis, plegamiento y degradación de proteínas, y a enzimas del metabolismo primario y secundario. Dos de ellas, la subtilisina y la chaperona GrpE aumentaron en tres poblaciones, lo que las hace especialmente interesantes para su validación en experimentos posteriores. De las proteínas variables totales encontradas en el experimento de doble estrés, cuatro se proponen como posibles marcadores de resiliencia, incluida una aldehído deshidrogenasa, una glucosa-6-fosfato isomerasa, la proteína ribosomal 50S L5 y la alfa-1,4-glucano-proteína sintasa. A pesar de los avances en el conocimiento de los mecanismos moleculares de respuesta y resiliencia a la sequía y P. cinnamomi generados en la presente Tesis, y considerando la alta variabilidad encontrada en Q. ilex, es importante señalar que los mecanismos y marcadores propuestos deben ser validados funcionalmente mediante estrategias de genética inversa, y confirmados para un mayor número de poblaciones e individuos antes de ser considerado como generales para la especie. El siguiente paso será comprender las bases genéticas y epigenéticas de la resiliencia y las diferencias entre genotipos. En esta dirección, la reciente secuenciación del genoma de la encina llevada a cabo en el grupo es un hito clave.